电镜免疫胶体金―银法染色技术

免疫胶体金―银染色(immunogold-sliverstaining)技术系20世纪80年代Holgate将免疫 金染色和银显影方法结合而建立的一种新型检测技术，亦可用于电镜包埋前染色。其基本原理是先进行免疫胶体金染色标记抗原，使其结合在组织细胞抗原所在位置，然后进行物理显影，当显影剂中的对苯二酚将银离子还原成银原子时，后者将围绕金颗粒形成一个“银壳”。“银壳”本身亦具有催化作用，进一步促使更多银离子还原，则使“银壳”越来越大，抗原位置因此而变得清晰，抗原信号也得以放大，故此法是最为敏感的细胞化学方法之一。因金颗粒的电子密度高，加之敏感性也高，故特别适合免疫电镜的抗原研究。

主要操作程序如下：

1. 组织固定后，5%、10%和20%系列浓度的蔗糖处理，制作冰冻切片，厚10～30gm；

2. 含1%正常羊血清或1%BSA的PBS室温孵育20分钟，封闭抗体非特异性结合部位；

3. 含1%氢硼化钠的PBS孵育20分钟；

4. 第一抗体孵育，可先置4℃，12～18小时，然后室温1小时，使抗体充分渗透并结合；

5. PBS漂洗3次，每次5分钟；

6. 0.1% BSA/PBS液(pH 8.2)漂洗5分钟，为胶体金结合提供碱性环境；

7. 胶体金标记的第二抗体(pH 8.2)室温孵育30～45分钟，需摸索最佳稀释度；

8. 硝酸银液避光处理2―10分钟，显影时间最好根据实验结果确定；

硝酸银液配制：双蒸水60ml，枸橼酸缓冲液10ml，对苯二酚1.0g溶于30ml双蒸水，将三者混合，完全溶解后，用前加入硝酸银液2.0ml(含35mg硝酸银)混匀；

枸橼酸缓冲液的配制：枸橼酸(C₆ H₈O-7H₂ O)25. 5g，枸橼酸三钠(NaC₆H₅O₇ 2H₂ 0)23.5g，用双蒸水溶解至100ml，即为pH 3.5的枸橼酸缓冲液。

9. 解剖显微镜下选取免疫反应阳性部位。1%OsO₄后固定30分钟，双蒸水漂洗；

10. 组织标本的脱水、树脂包埋、超薄切片制作及电镜观察等方法同前述。

主要优点：

该方法形成的金银颗粒电子密度高，反差强，敏感度高；包埋前染色的标本可在解剖显微镜下选取阳性部位，结合半超薄切片的应用，能明显提高工作效率，特别适于抗原含量少的组织细胞的免疫电镜研究。缺点：显影处理需在暗室进行，操作较繁琐；而且增加包埋前免疫染色处理的步骤易导致非特异性着色；另外，单个金颗粒周围结合的银粒子不甚牢固，漂洗等处理容易脱离，半定量研究时应注意；此外银等废液直接流人下水道，容易导致环境污染。