病毒的分离实验

实验步骤

标本的采集：

病毒分离常用的标本有血液，脑脊液，粪便，直肠拭子，咽喉含漱液，咽拭子，尸检组织等。所取标本的种类视疾病性质而异。如呼吸道疾病常取咽喉洗液，咽拭子；消化道疾病取粪便，直肠拭子；神经系统疾病取脑脊液，粪便等。采取标本时应避免污染，有些标本如粪便，咽喉洗液，虽本身含有大量杂菌，但为保持良好工作习惯，仍应用无菌手续操作，同时可避免标本之间相互污染及保护工作人员的安全。标本取得后应放于消毒容器内，外面贴上患者姓名及采取日期，同时用专门表格登记标本编号，患者姓名，性别，年龄，住址，临床诊断，发病日期，症状及采取标本日期等。

标本采集具体方法如下：

1、  粪便标本：挑取小指头大的粪便（约2 克左右）放入无菌广口瓶或硬纸盒中。

2、  直肠拭子：如果急于需要得到粪便标本作病毒分离，可采取直肠拭子，其方法为用无菌棉拭子浸入Hank‘s 液或生理盐水，塞入直肠内，略加转动，待其沾有肠内容物，取出置于盛有2 毫升Hank's 液或生理盐水的试管中。

3、  咽喉漱液：采集前让病入咳嗽数次，然后用Hank's 液（或肉汤，生理盐水等）10～15 毫升，分2～3 次含漱，让患者仰头使液体在咽喉中反复冲洗，含漱液吐于无菌广口玻瓶内。

4、  咽喉拭子：如欲从咽喉部分离病毒，而患者为小儿不能含漱时，可用无菌棉拭子两支仔细涂擦咽喉部，然后将棉拭子放人盛有2 毫升Hank's 液或生理盐水的试管内。

5、  脑脊液：如为中枢神经系统的病毒感染患者，可在腰穿时留取脑脊液l～2 毫升放于无菌试管中。

6、  血液：在疾病早期（发病后2～5 日内）自肘静脉无菌取血2～5 毫升，放于含有肝素的试管中，充分混合备用（或直接放入试管使成凝块）。

7、  尸检材料：死亡患者尸体解剖时，可无菌采集各种脏器组织标本放无菌小瓶中（或内加50% 中性甘油盐水）备用。

标本的保存与运送：

1、  标本的保存：标本采集后应尽快送检。在送到实验室之前可暂时存放4 ℃冰箱内保存。标本送到实验室后，应尽快接种，或保存在-20 ℃以下的低温冰箱中。

2、  标本的运送：大多数病毒标本都应冷藏运送，可将标本用塑料袋包裹，再放再冰壶中运送（内放冰块或干冰）。

标本的处理：

病毒分离是用活的组织细胞，如被检材料中混有杂菌，则培养不会成功，故在接种前应将材料处理。具体方法如下：

1、  粪便标本：取回标本应及早处理。方法如下：称取1 克粪便加4 毫升Hank's 液（预先用NaHCO3 调整pH 7.2～7.4）；用竹签搅拌捣碎粪便即成20% 悬液。将悬液置-20 ℃低温冰箱冷冻保存至少一夜；于做病毒分离工作前一天将粪便悬液取出，经3 000 转/分离心沉淀30 分钟，吸取上清，每毫升加入青霉素1 000 单位，链霉素1000微克（以下简称双抗），置4 ℃冰箱作用4 小时或过夜，即可供作病毒分离。

为除去粪便内的毒性物质，可采用植物活性炭处理。方法如下：事先配制好5% 活性炭Hank's 悬液，充分撼动混匀后，每管按4 毫升分装。用时每管加粪便1 克，制成20% 悬液，于4 ℃放置2～4 小时以吸附活性物质，其间应摇动几次，吸附后再置于-20 ℃低温冰箱保存，以后步骤同前。

2、  直肠拭子：将棉拭子在盛有Hank's 液的试管壁上压挤使标本材料洗出，经3 000转/分离心沉淀30 分钟，取上清加双抗，置4 ℃作用4 小时或过夜，用作病毒分离。

3、  咽喉拭子和咽喉含漱液：处理方法基本与直肠拭子相同。

4、  脑脊液及血液：正常无菌，如怀疑有细菌污染时，可向样品中加入双抗，4 ℃过夜备用。如为血块时，用前冰箱取出，在无菌乳钵（或放玻璃砂）中磨碎，加等量Hank's 液制成乳剂供分离用。

尸检标本：取出标本后，用无菌蒸馏水洗去甘油，用无菌乳钵磨碎，再用Hank's 液制成l0% 悬液经3 000 转/分分离沉淀30 分钟，取上清加双抗，置4 ℃过夜，次日作病毒分离。