病毒RNA提取实验

TMV病毒液

TE-饱和酚:氯仿 氯仿 NaAc 乙醇 TE缓冲液 双菌水

冷冻台式离心机 低温真空干燥仪 电泳仪 电泳槽

一、实验材料准备

1.  材料
 

提纯TMV病毒液（10 mg/ml）。
 

2.  设备
 

冷冻台式离心机，低温真空干燥仪，电泳仪，电泳槽。
 

3.  试剂
 

TE-饱和酚:氯仿（1:1），氯仿，3 M NaAc(pH5.2)，乙醇(100%和70%)，TE缓冲液，无RNA 酶的双菌水。
 

二、操作步骤
 

1.  取一eppendorf管加入提纯TMV（10 mg/ml)400 ml，再加入等体积酚/氯仿，盖紧管盖后用手充分振荡1分钟，4℃下12 000 g离心10分钟。
 

2.  吸取水相于一新eppendorf管，再用酚/氯仿抽提，直至水相和有机相交界面无蛋白为止。
 

3.  吸取水相于新eppendorf心管，加入等体积氯仿，用手倒置离心管数十秒，4℃下12 000 g离心10分钟。
 

4.  取水相，加入1/10倍体积的3 mol/L NaAc(pH5.2)，2.5倍体积的冰冷乙醇，混匀，-20℃30分钟。
 

5.  4℃下12 000 g离心15分钟，小心弃去上清液，用70%乙醇洗涤沉淀，4℃下12 000 g离心5分钟。
 

6.  小心弃去上清液，沉淀真空干燥5分钟或空气干燥10分钟，并溶于无RNA 酶的双菌水或TE缓冲液中。
 

7.  取10 ml进行电泳分析。

1.  整个操作应尽可能在低温下进行。
 

2.  由于病毒RNA 镶嵌于外壳蛋白里面，因此要充分剥去病毒外壳蛋白，一般需要多次进行酚/氯仿的抽提。