“盐桥”牵线：围剿癌症之王

　　新型抑制剂可以特异性地靶向突变的KRAS-G12D蛋白，如同后羿射日一样瞄准癌症细胞将其“击落”，而不会影响正常的细胞的生长。受访者供图

　　胰腺癌被称为“癌症之王”。这是一种最为依赖KRAS基因突变的肿瘤。如何开发有效的KRAS抑制剂，是临床药物治疗上的迫切需求。

　　1月25日，《细胞—发现》(Cell Discovery)在线发表了清华大学药学院教授张永辉团队和湖北大学生命科学学院教授郭瑞庭团队的合作研究成果。他们发现了一款靶向KRAS—G12D的长效抑制剂，并通过晶体学研究揭示其独特的双态靶向结构基础。这将为抗胰腺癌药物研发提供新思路。

　　KRAS-G12D是胰腺癌最普遍的突变类型 受访者供图

　　挑战“不可成药”魔咒

　　“尽管现代医学的发展使很多癌症可控甚至治愈，但胰腺癌由于难诊断难治疗，成为科学家尚未攻克的癌症之一，因此被称为‘癌症之王’。”论文通讯作者张永辉在接受《中国科学报》采访时说，胰腺癌是一种恶性程度极高的消化系统肿瘤，也是实体瘤中致死率最高的癌症类型之一。

　　胰腺癌的一个重要特点是，约90%的肿瘤中携带着KRAS基因突变。可以说，胰腺癌是最为依赖KRAS基因突变的肿瘤类型之一。

　　KRAS蛋白能给予细胞指令促进其生长或分裂，如果因为遗传物质突变导致KRAS蛋白在某些细胞中过度激活的话，这些细胞就会不受抑制地进行分裂，这就是癌症的开始。

　　KRAS基因来自于著名的RAS家族，这个家族中的NRAS、HRAS和KRAS突变引起的癌症占所有人类癌症近1/4，几乎覆盖了所有的癌症类型，每年在全球造成100万人死亡。

　　其中，KRAS突变占所有RAS突变的85%，是最常见的致癌基因。KRAS突变存在于90%的胰腺癌中，30~40%的结肠癌中，15-20%的肺癌中(大多为非小细胞肺癌)。

　　而胰腺癌的KRAS突变亚型中，G12D最为普遍，约占胰腺癌的36%。因此，临床上迫切希望开发出有效的KRAS—G12D抑制剂。

　　然而，笼罩在KRAS基因突变上空的是“不可成药”“无药可靶”的魔咒。

　　论文共同通讯作者郭瑞庭解释到：“我们在药物研发时，会仔细观察靶标蛋白的结构，寻找能结合两个关键位点的化合物。具有‘深口袋’结构的靶标蛋白是比较理想的，这样药物就可以进入其中，并与多个位点结合，从而发挥药效。”

　　然而，KRAS蛋白体积小、表面光滑，像一个闪亮光滑的小球，缺乏传统小分子药物可以结合的“深口袋”结构，一度被认为是“不可成药”的靶标。

　　此外，它在激活状态下与三磷酸鸟苷(GTP，细胞中的能量载体之一)结合紧密，这增加了抑制处于激活状态下的KRAS蛋白的难度。

　　挑战KRAS—G12D“不可成药”的魔咒，是摆在科学家面前的一道难题。

　　一座设计精巧的盐桥

　　“胰腺癌常见的致癌性KRAS—G12D突变体抑制剂的研发一直进展不佳。”张永辉说，最近的研究探索了多种靶向KRAS—G12D的方法，可是这些分子都不能有效靶向KRAS—G12D。

　　不久前，美国安进公司(AMGEN)开发了针对KRAS—G12C的抑制剂，它可以共价结合KRAS突变体第12位上的半胱氨酸C12。该抑制剂已经获得美国食品药品监督管理局(FDA)批准，可用于治疗携带KRAS-G12C突变的非小细胞肺癌患者。尽管KRAS—G12C突变在胰腺癌中仅占2%，KRAS—G12C抑制剂仅被批准治疗非小细胞肺癌，但依旧让科学家看到了寻找胰腺癌KRAS成药的希望。

　　为了进行精准的药物设计，他们首先搞清楚了KRAS—G12D的三维结构。

　　药物筛选得到的两个优势化合物 受访者供图

　　“我们仔细研究了KRAS—G12D的晶体结构。假设突变体第12位天冬氨酸的羧酸基团在生理条件下脱去质子，这个时候我们就可以引入烷基胺基团，该基团与羧酸部分形成‘盐桥’的相互作用。这种强的盐桥相互作用，本质上与前面提到的KRAS—G12C抑制剂和半胱氨酸之间的共价作用是类似的。”郭瑞庭介绍。基于盐桥的策略，他们设计合成了一系列化合物，利用核苷酸交换、ITC分析、抗细胞增殖实验对其体外活性进行了表征，最终层层筛选得到两个优势化合物：TH-Z827和TH-Z835。

　　“这两个化合物对KRAS突变型胰腺癌细胞具有良好的抑制活性，在对胰腺癌异种移植小鼠的动物实验也观察到了肿瘤体积的显著减少。”张永辉说。

　　那么，这两个化合物究竟是如何发挥抑制作用的呢?

　　晶体学研究揭示独特作用机制

　　抑制剂分子通过盐桥与KRAS-G12D结合 受访者供图

　　论文共同第一作者、湖北大学省部共建生物催化与酶工程国家重点实验室杨钰介绍，在KRAS蛋白中有一个核苷酸结合位点，可与二磷酸鸟苷(GDP)或三磷酸鸟苷(GTP)结合。KRAS蛋白就在与GDP结合的“不活跃”状态和与GTP结合的“活跃”状态之间循环转换。

　　“这两种状态的转换区构象有很大差异，迄今为止，没有一种KRAS —G12C抑制剂能够有效地靶向KRAS活性状态。”杨钰说。

　　郭瑞庭告诉《中国科学报》，他们这个结构生物学团队与张永辉团队有数十年的良好合作基础，在这项研究中解析了三个抑制剂分子与KRAS—G12D的晶体结构。

　　结果发现，这些G12D抑制剂的结合模式与G12C抑制剂是截然不同的，有着独特的结构作用机制。

　　杨钰说，他们在TH-Z835的晶体结构中观察到，其与第12位天冬氨酸之间形成了盐桥作用，并借助盐桥在光滑的KRAS表面“挤开”一个“口袋”一样的结构。KRAS—G12D抑制剂就此结合在这个“口袋”里面，同时与周围多个重要氨基酸形成关键氢键作用。

　　郭瑞庭认为，基于上述机理开发的抑制剂可以针对性地与KRAS—G12D突变体结合，使它不再向细胞发出生长或分裂指令，也就是KRAS突变蛋白失活了。而正常的KRAS蛋白没有受到影响。从而达到靶向抑制癌症的目的。

　　“这些在晶体结构中观察到的独特作用机制，很好的解释了我们在同时靶向活性态和非活性态KRAS方面取得的成功：空间碰撞使G12C抑制剂无法靶向GTP结合态的KRAS—G12C，而我们的G12D抑制剂通过形成盐桥，获得了足够的空间来同时靶向活性态和非活性态KRAS—G12D。”郭瑞庭说，这项对KRAS突变型胰腺癌细胞和异种移植模型小鼠的研究对抗癌药物的研发具有深远的医学意义。

　　相关论文信息：https://doi.org/10.1038/s41421-021-00368-w