目的基因片段的PCR扩增与克隆

1.PCR技术

PolymeraseChainReaction聚合酶链反应

它是一种模拟天然DNA复制过程，在有DNA模板、DNA聚合酶（Taq酶）、RNA引物和四种dNTP的情况下，通过高温变性（90℃－95℃，1－2min）,低温退火（25℃－37℃，1－2min）,中温延伸（60℃－75℃，90sec-5min）,这样反复循环的过程中，在体外扩增特异性DNA片段的分子生物学技术。

1）、PCR反应成分：

TaqDNA聚合酶

引物浓度：一般0.1-0.5μmol/L

dNTP:一般为50－200μmol/L

Mg²⁺

模板：PCR对模板的要求不高，单、双链DNA均可，但样品中不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂以及能与DNA结合的蛋白质。

添加剂：DMSO（二甲基亚枫），提高扩增效率及特异性

（1）理论上PCR合成产物的数量经过每轮循环都将增加一倍，应按2ⁿ的指数方式递增，PCR反应30轮循环后，PCR扩增应达到230个拷贝，约10⁹个拷贝。但由于DNA聚合酶的质量、待扩增片段的序列及反应系统的条件等各种因素的影响，实际扩增效率比预期的要低，一般可达10⁶－10⁷个拷贝

平台效应”：PCR反应中，当引物－模板与DNA聚合酶达到一定比值时，DNA聚合酶催化反应趋于饱和，即PCR反应不再增加。平台效应在PCR反应中是不可避免的，但一般在平台效应出现前，PCR产物的数量足以满足实验的需要。

（2）PCR反应条件的优化

PCR方法操作简便，但影响因素颇多，因此需要根据不同的DNA模板，摸索最适条件。主要从：

反应的特异性、敏感性、真实性、扩增效率等四个方面衡量PCR反应的结果。

①循环参数 变性 退火 延伸

②PCR反应成分

（3）PCR反应引物的设计

引物的设计在整个PCR扩增中占有十分重要的地位。