直接分辨单个氨基酸分子小小纳米孔破解蛋白质测序难题

蛋白质是生命活动的主要承担者。测量组成蛋白质的氨基酸的排列顺序被称为蛋白质测序。由于缺乏普适、高效的测序技术，人类对蛋白质的了解还极其有限，生命世界的诸多奥秘仍待破解。

近日，浙江大学化学系冯建东团队提出了基于固体纳米孔的氨基酸识别方法。他们构建了直径为1纳米左右的人工纳米孔，可进行单个氨基酸分子的精准识别，分辨率达到0.94道尔顿。这显示出人工纳米孔应用于单分子蛋白质测序的可能性。相关研究论文发表于《自然·通讯》。

一项持续了60多年的挑战

1951年，英国科学家弗雷德里克·桑格完成了对胰岛素的测序工作，并因此获得诺贝尔化学奖。这是人类第一次测定蛋白质的氨基酸组成，从此人们认识到蛋白质具有特定的氨基酸序列。

但此后，桑格在蛋白质测序方面陷入了持续10年的瓶颈期。他转而尝试进行DNA测序和RNA测序，发明了后来被称为“桑格测序法”的双脱氧测序法。该方法被广泛应用于测定基因和基因组序列，这项发明改写了整个生命科学的研究进程和途径，引领了人类三大科学计划之一的基因组计划和基因测序领域的飞速发展。

基因测序方法发展迅猛，而与之相较，蛋白质测序发展无疑是滞后的。“蛋白质测序‘起跑’比基因测序早，但没有像基因测序技术那样被广泛应用。”浙江大学生命科学研究院研究员蒋超说，比起基因，人们对蛋白质的了解要少得多。基于此，一种普适高效的蛋白质测序手段的诞生有着重大意义。

相比于基因测序，蛋白质测序遇到的主要困境在于其结构复杂且构成的单元氨基酸具有更强的异质性，这意味着蛋白质测序手段所需的检测灵敏度要高得多。蛋白质也没有类似核酸扩增的技术，导致目前人们难以分析低丰度蛋白质，因此在单分子层面上对蛋白质进行测序的需求日益迫切。

蒋超介绍，目前测量蛋白质的氨基酸序列的主流方法是利用质谱仪，但此方法在检测速度、读取长度和灵敏度方面还存在很多不足之处，其效力远不及基因组学和转录组学。

“纳米孔主要可分为两大类，一类是生物纳米孔，一类是固体纳米孔，目前应用较多的生物纳米孔本身由肽链折叠而成，所以其灵敏度受限于纳米孔本身的尺寸。”冯建东认为，要解决蛋白质测序的研究需求，必须从根本上突破传统纳米孔灵敏区域的长度限制。

纳米孔“盲盒”挑战测量极限

想搞懂纳米孔测序，不妨将其理解为一个拆盲盒的过程。假设盲盒里有一条项链，玩家仅知道这条项链由几颗珠子构成，不同颜色珠子的排列方式要靠猜测。

冯建东说，盲盒里如果是某个基因“项链”，对应基因有4种不同的碱基，猜的就是4种颜色珠子的排列顺序。而对于蛋白质“项链”来说，组成蛋白质的有20种天然氨基酸，其排列组合数量就将飙升到天文数字。

“结构决定分辨能力。如果我们把单个的孔做到足够小，只容许孔内有一个氨基酸分子，那么它的信息就有可能被精确识别。”冯建东介绍，团队尝试人工创造一个具有单个氨基酸敏感性区域、几乎是目前世界上最小的人工纳米孔，这样纳米孔测量的“盲盒”内就可以仅存1个氨基酸。

“类似于不同体型的人过一扇窄门，有的人可以顺利通过，有的人则会被挡在门外。”冯建东说，科研人员通过电压在一张三层原子厚度的二硫化钼上“戳”出一个洞，其实是让它丢掉一些原子，开出一扇仅容许一个氨基酸通过的“门”。这扇“门”的直径在亚纳米到1.6纳米之间。

“不同氨基酸的体积不同，且表面带一定的电荷，当它们通过纳米孔时，通过纳米孔的离子电流会受到微小的扰动。当不同的氨基酸经过这扇‘门’时，受到的扰动程度就会不一样。”团队成员、浙江大学化学系博士生王馥实介绍，研究人员通过区分扰动程度来识别不同的氨基酸。

蛋白质单分子测序再进一步

研究人员通过对纳米孔的极限结构的设计，将当前纳米孔测量分辨率推进到0.94道尔顿，实现了直接分辨单个氨基酸分子的目标，并且可在同一纳米孔内区分16种不同类型的天然氨基酸，解决了纳米孔蛋白测序空间分辨率的核心难题。

冯建东认为，使用纳米孔高精度识别单个氨基酸的策略，为纳米孔单分子蛋白质测序提供了物理解析的可行性基础。

自然界的蛋白质分子有着难以想象的复杂性，除了序列，不同的化学修饰的变化也会产生丰富的“变异”，而这些“变异”与人类疾病息息相关。比如，蛋白质的异常糖基化修饰会导致多种重大疾病，如白血病、阿尔茨海默病等。

蛋白质的磷酸化修饰在细胞周期、生长、凋亡和信号转导等过程中起着重要的调控作用。在这项工作中，研究人员实现了用纳米孔来识别氨基酸的磷酸化。这一结果表明纳米孔未来有望应用于医学检测，助力疾病诊断和预防。

“目前，我们的方法可以用于分辨不同的单个氨基酸分子；将来，希望能够一次性识别更复杂组合的多肽链，以及复杂的化学修饰。”冯建东表示，蛋白质测序是目前纳米孔领域最受关注的应用之一，单个氨基酸分子的识别是一个好的开端，后续如何完成对从氨基酸到肽链，再到复杂折叠的蛋白质的识别仍是更大的挑战和机遇。