直接原位PCR（InsituPCR）

原位PCR是原位杂交细胞定位和PCR的高灵敏度相结合的技术，使得靶基因检测有了极大的改进。此技术是在细胞（爬片、甩片或涂片）或组织（石蜡、冰冻切片）上直接对靶基因片段进行扩增，通过掺入标记基团直接显色或结合原位杂交进行检测的方法。

一、组织切片和细胞样品的制备

试剂与配置

10%福尔马林；二甲苯；PBS

操作方法

1. 用10%福尔马林固定组织8~15hr，石蜡包埋，切片（4μm），将切片置于新鲜的二甲苯中处理5min，放入无水乙醇中浸泡5min，取出，空气干燥；

2. 对于培养细胞，可直接制备爬片，也可有PBS洗细胞一次，加10%福尔马林静置过一夜，用橡胶刮下细胞；用PBS洗细胞两次，2000rpm×3min，用5ml PBS重悬细胞，即可用甩片机甩片或直接吸50μl点在载玻片上。

二、切片预处理（蛋白酶消化）

试剂与配置

0.1mol/L Tris-HCl (pH7.4)

缓冲液A：0.1mol/L Tris-HCl (pH7.4)，0.3% Tween-20，0.5% NP-40

蛋白酶K：20-50μg/ml，溶于TE中

操作方法

1. 干燥后的切片置于0.1mol/L Tris-HCl (pH7.4)中，室温孵育5min；

2. 浸入缓冲液A中，室温孵育10min；

3. 滴加20μl蛋白酶K液于标本上，在湿盒中37℃孵育20min；

4. 在室温下，用0.1mol/L Tris-HCl (pH7.4)漂洗两次，每次5min。

三、原位扩增（以标记生物素为例）

试剂与配置

PCR反应缓冲液：两种引物各100pmol，dATP、dCTP、dGTP和dTTP各200μmol， Bio-dUTP 50mol，1×PCR缓冲液；

Tag酶：5U/μl

缓冲液B：0.01mol/L PBS，0.1% Triton-X100

指甲油（市售）

无水乙醇

操作方法

1. 切片用1×PCR缓冲液平衡3次，每次5min；

2. 用滤纸吸去切片上多余的液体，置60℃，每片加入30μl PCR反应缓冲液，5U Tag酶，用盖玻片封片，四周封以指甲油，防止蒸发；

3. 94℃变性5min，按下列条件（94℃×2min，55℃×2min，72℃×3min）循环20~25次后，72℃延伸5min；

4. 玻片浸入无水乙醇中10min，以软化指甲油；

5. 用刀片撬开盖玻片并除去；

6. 用缓冲液B漂洗两次，每次3min；

7. 用无水乙醇固定5min，并吹干。

四、检测（以ABC法为例）

试剂与配置

缓冲液C：0.1mol/L Tris-HCl (pH7.5)，0.1mol/LNaCl，2mmol/L MgCl₂， 0.5% Triton-X100

封闭液：3%BSA（溶于缓冲液C中）

显色液：0.05%DAB，溶于0.05mol/L Tris-HCl (pH7.4)，临用前每10ml加30%过氧化氢50μl

1%盐酸酒精液

苏木素染色液

操作方法

1. 用30μl 3%BSA滴加在玻片上，封闭1hr；

2. 用缓冲液C简洗1min，每片滴加ABC复合物20～30μl，室温放置40min；

3. 缓冲液B室温漂洗3次，每次15min；

4. 滴加显色液于玻片上，镜下观察控制显色时间（一般7～14min）；

5. 流水洗片，浸入苏木素液中复染30s，1%盐酸酒精分化（提抽2次）；

6. 常规脱水、透明、封片，镜下观察。