研究发现PANDAS复合物在piRNA调控异染色质形成的分子机制

　　转座子（transposon）由冷泉港实验室Barbara McClintock（诺贝尔奖）首先在玉米中发现。转座子又被称为“跳跃基因”，类似于内源性病毒，能够在宿主基因组中“复制和粘贴”自己的DNA，以达到其自我“繁殖”的目的。转座子的“跳跃”可能会产生基因组不稳定性，并导致动物不孕不育。有多种调控机制沉默转座元件并维持基因组完整性，例如组蛋白修饰和DNA的甲基化等。为了抵抗转座子，动物的生殖系统进化出了一类小非编码RNA——piRNA（Piwi-Interacting RNA）——来严格调控转座子的表达。概念上，真核生物的piRNA通路在功能上类似于原核生物的CRISPR系统。

　　piRNA簇（piRNA cluster）表达的piRNA长度大约在24到31nt之间，通过与PIWI家族蛋白（Argonaute家族蛋白的一个亚家族）形成piRISC复合物（piRNA induced silencing complex）而起作用。piRISC复合物能在转录（TGS，Transcriptional gene silencing）和转录后水平的沉默转座子（PTGS，Post-transcriptional gene silencing）上起作用。PTGS主要通过“乒乓循环”（ping-pong cycle）在切割piRNA靶标的同时产生更多的新生piRNA，从而形成类似“先天免疫系统”的正反馈，在细胞质层面降解转座子RNA。TGS是在转录水平沉默目标转座子——最终结果是诱导转座子插入位点形成组成型异染色质。转座子的沉默通常跟组蛋白修饰（H3K9me3）有很强的相关性。目前认为，Piwi/piRNA复合物通过转座子新生RNA招募Panoramix（Panx），并最终导致转座子区域异染色质的形成，该过程需要H3K9me3甲基化转移酶SetDB1/Eggless和H3K4me3去甲基化酶LSD1。

　　9月30日，中国科学院生物物理研究所俞洋团队和中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所黄旲团队（现上海交大医学院）在Nature Cell Biology 杂志上以长文形式在线发表了题为A Pandas complex adapted for piRNA-guided transcriptional silencing and heterochromatin formation 的研究，该工作在俞洋/Hannon之前的工作基础上进一步深入阐明了piRNA介导的转座子异染色质形成的分子机制。该研究发现，生殖细胞特异表达的核转运因子（NXF）家族蛋白dNxf2能与dNxt1（P15）以及Panx形成三元复合物，并通过竞争性结合阻止dNxf1（又叫TAP，是介导mRNA出核的经典接头蛋白）与核孔互作，从而导致了转座子新生RNA在核内的滞留。该文章首次证明PANDAS（Panoramix-dNxf2 dependent TAP/p15 Silencing）复合物的存在，并提出了RNA介导异染色质形成的新理论，既阻断新生RNA出核在调控异染色质过程中起核心作用，又为将来研究其它RNA介导的表观遗传调控提供指导意义（图1）。该文章的发表，也给今年四月份在BioRxiv同时上线的关于Drosophila Nxf2的四篇预印本文章之间的良性竞争画上句号。

　　该研究中，俞洋课题组充分利用果蝇这一模式生物的优势，综合分析针对piRNA通路的全基因组RNAi筛选结果和flybase中全蛋白组免疫沉淀质谱的大数据，再结合已建立的RNA拴住报告基因筛选体系，首先快速锁定了dNxf2在piRNA/Panx介导的转座子沉默过程中的核心作用。与此同时，俞洋课题组通过和专注于piRNA通路的结构生物学家黄旲课题组的精诚合作，解析了Panx-dNxf2互作结构域的晶体结构。作者通过晶体结构的分析发现，dNxf2的UBA结构域一方面进化出跟Panx直接互作的疏水界面，另一方面也丢失了一般NXF家族蛋白固有的结合核孔复合物的能力（从而解释了为什么dNxf2不能像dNxf1一样介导mRNA出核），为在分子层面进一步理解dNxf2的作用机制奠定了坚实基础（图2）。

　　由于dNxf2能跟Panx能形成相互依赖的复合物，dNxf2有着跟Panx类似的诱导基因沉默的功能，即可以通过新生RNA介导基因沉默和异染色质形成。和其它经典piRNA通路蛋白一样，dNxf2的缺失会导致动物体完全不孕不育。有趣的是，小鼠的Nxf2敲除之后在特定条件下也有不育的表型。一系列分子生物学实验和遗传学（co-IP/IP mass spec，GST pull-down，Y2H，GoldCLIP等）也证实dNxf2确实是Panx介导转座子沉默过程中的核心蛋白。但是，作者在研究过程中发现，在dNxf2缺失并一同过表达Panx的条件下，转座子的H3K9me3基本保持不变。具有讽刺意味的是，在此条件下果蝇却是完全不育的，因为转座子仍然是大规模上调的。该结果也直接暗示两点：1. H3K9me3只是异染色质形成的必要非充分条件。2. dNxf2调控转座子沉默的分子机制不仅仅是招募Panx以及下游的甲基化转移酶SetDB1那么简单。

　　通过大量的文献阅读以及跟研究RNA出核方面的专家（程红）讨论，作者意识到如果仅是dNxf2自身失去核孔复合物结合能力并不足以解释为什么转座子RNA不能出核。dNxf2还需要阻止经典的mRNA出核通路，即通常依赖于mRNA 的5’Cap结构招募的dNxf1（TAP）复合物。而前人研究也暗示NXF家族蛋白有能力形成异元二聚体，因此，作者大胆假设dNxf2可能通过抑制dNxf1复合物来阻止转座子mRNA的出核。令人兴奋的是，各方面数据包括co-IP，GST pull down，Split luciferase和交联质谱等都充分支持dNxf2：dNxf1能直接互作（图3）。

　　最后，作者通过体外竞争实验和体内瞬时RNA拴住实验为dNxf2抑制dNxf1介导的RNA出核功能这一假说提供了充分的证据（图4）。非常有意思的是，程红课题组最近在哺乳动物的细胞的研究表明Nxf1是RNA聚合酶Pol II有效延伸（transcription elongation）所必须的。因此，dNxf2抑制Nxf1的后果很可能不仅仅是阻止转座子RNA的出核，很有可能PANDAS会导致Pol II转录延伸的停止。虽然这个理论亟待证实，但是它可以被完美地统一在现有的piRNA介导转座子转录沉默的模型中。