硝酸纤维素滤膜结合实验确定RNA蛋白质解离常数实验

核酸酶

缓冲液

硝酸纤维素滤膜 灭菌瓶 聚丙烯微量滴定板 点杂交装置 移液器 微孔玻璃过滤装置

一、材料与设备

所有缓冲液必须用去除离子、有机物和生物污染的去离子水配制，但是核酸酶污染还是一个常见的问题，每个溶液必须采用硝酸纤维素滤膜过滤除去核酸酶，溶液储存在灭菌瓶中。使用移液管或塑料吸头转移液体，使用高纯度的试剂以避免核酸解的污染，否则可能造成解离常数的改变。

1. 点杂交所用装置如下：

(1) 4 英寸 X 5 英寸的 Schleicher 和 Schuell （Keene 公司，NH，USA）0.2 μm 硝酸纤维素滤膜 ( BAS ) 或者 4 英寸 X 5 英寸的  DEAE 膜和 4 英寸 X 5 英寸的 Schleicher 和 Schuell 0.15 μm 的硝酸纤维素滤膜（BA45）。

(2) 96 孔聚丙烯微量滴定板。

(3) 点杂交装置。

(4) 八道移液器。

2. 单个滤膜装置：

(1) 硝酸纤维素滤膜：Schleicher 和 Schuell BA85 0.45 μm 或 0.2 μm 的滤膜。

(2) 25 mm 微孔玻璃过滤装置。

将硝酸纤维素滤膜置于塑料袋中储存在 4℃ 防止干燥，陈旧的滤膜容易发生不均匀的湿润，干燥时易碎而变得不可靠。必须记住当过度加热或者敲击时硝酸纤维可以发生破裂，陈旧的则更加易碎。

聚丙烯微量滴定板使用前在 1 mol/L HCl 中浸泡 30 min，以去除痕量的 RNase 或黏附的蛋白，这样处理后可以多次使用。聚羧酸酯或聚苯乙烯板没有杭酸性能，更容易在表面黏附蛋白。

二、操作方法

1. 在合适的缓冲液和温度下预先湿润硝酸纤维素滤膜，此过程至少要 30 min，保证所有的面都接触到缓冲液，没有被缓冲液充分饱和的滤膜必须丟弃，避免手指接触到滤膜。

2. 在微量滴定板上加入一定体积的样品，用不断增加的蛋白滴定定量的 ³²P 标记 RNA，用仅含 RNA 的孔作为对照，测量滤膜非特异性的 RNA 结合能力，一个常规的曲线应该涵盖 3 到 4 个蛋白浓度的数量级，每组最少 5 个点（推荐更多的点来更准确的确定 中间点），高于（饱和）或低于（未饱和）基线的点都要适当。每个试验平行进行两次并取平均值。

3. 在润湿后去除过量的缓冲液，用 Kimwipe 轻微封闭制备滤膜，以防止样品在膜上的扩散。

4. 在过滤前，将膜插入到装置中，打开真空泵即将样品从板转移到滤器，从最低浓度的蛋白样品开始滴加，逐渐到高浓度，同一个滴头可以在一个滴定过程中使用，过长时间的吸滤将导致过多滞留，因此此步必须迅速，所以在一个滴定时使用同一吸头。在滤膜 和溶液之间可能产生气泡而阻止过滤，这些气泡必须清除，轻拍装置的边缘即可以达到目的。过分浓缩的蛋白在抽吸时也可能产生泡沬，这是蛋白变性的标志，所得结果也就不准确。

5. 移去滤膜小心吸干底下过量的缓冲液，以防止在表面扩散，导致单个的点变得模糊。

6. 采用感光成像仪测定结合在滤膜上的 RNA，可以在滤膜干燥或潮湿时进行，如果膜是湿润的，将其包裹在 Saran 膜中再进行测定。直接测定结合的放射标记的 RNA 量， 结合量 (B) 和总量（T）直接进行比较，在没有蛋白的情况下结合到膜上的 RNA 作为背景 ( O )，从每个数据点去除，得到（B-O）/T=F_B（片段结合），F_B 对蛋白质浓度的对数作图即得到结合等温线。

7. 分析结合检测结果，复合物的形成假设为两个分子的结合，结合的化学式是 1:1，在 Langmuir 等温线中查到数据对应的值即得到解离常数，下面是 Lin 和 Riggs 给出的公式：




常数 C 适合于基线以上（即当滞留率不足），可以用来标准化变化的滞留率。仅当一个单个数据列被标准化以后，才可以用复制的数据列进行分析，因此从最初的过滤获得 C 值，每个 F_B 除以参数 C 得到 F_Bnom，它作为蛋白浓度的一个函数，用 F_Bnom 代替 F_B，去掉 C（或设为 1）再做一次。为了分析单个的数据列，一个 Macintosh 系统下的绘图软件例如 KaleidaGraph^TM 或 PC 就足够了（Synergy Software），其他的一些软件包可以处理更加复杂的分析，包括 Scientist^TM（MicroMath Sciennfic Software 公司）。