硝酸还原酶活性的测定实验

实验方法原理 硝酸还原酶是植物氮素代谢作用中的关键酶，与作物吸收和利用硝态氮的能力相关。它催化NO3－还原为NO2－的反应：

NO3－+NADH+H+→NO2－+NAD++H2O

反应产生的NO2－可从组织内渗透到外界溶液中，定时测定一定的反应溶液中NO2－含量的变化情况则可了解此酶的活性大小。NO2－的定量测定是用磺胺比色法。此法简单易行而又非常灵敏，可测出0.5微克/  ml NaNO2含量的变化。

试剂、试剂盒 磷酸缓冲液KNO3溶液磺胺试剂α－萘胺试剂 NaNO2标准溶液

仪器、耗材 721型分光光度计真空泵保温箱天平真空干燥器打孔器三角瓶移液管烧杯

实验步骤

一、材料和设备

蓖麻、烟草、向日葵、油菜、小麦或棉花的叶片。

721型分光光度计、真空泵（或注射器）、保温箱、天平、真空干燥器、打孔器、三角瓶、移液管、烧杯

药品

0.1 M 磷酸缓冲液（pH7.5）

0.2 M KNO3溶液

磺胺（对氨基苯磺酸胺）试剂：1克磺胺溶于25毫升浓盐酸后再用蒸馏水稀释至100 ml 。

α－萘胺试剂：0.2克α萘胺溶于25 ml 浓盐酸中，再用蒸馏水稀释至100 ml 。

NaNO2标准溶液：1克NaNO2溶于1000  ml 蒸馏水中配成NaNO2母液。实验时按处理稀释成要求浓度。如1微克/ ml ：取母液1 ml ，用蒸馏水稀释成1000 ml 。

二、实验步骤

1．将新鲜取回的材料叶片用水清洗后用吸水纸吸干水份。用打孔器取下直径为1厘米的园片，再用蒸馏水洗2－3次，将蒸馏水吸干。在天平上称取等重的叶子园片两份：每份0.4克左右（或每份取50个园片）。将两份园片分别置于下列两种溶液中，容器使用50  ml 三角瓶。

（1）0.1 M 磷酸缓冲液5 ml +蒸馏水5 ml 。

（2）0.1 M 磷酸缓冲液5 ml +0.2 M KNO3溶液5 ml 。

将三角瓶置于真空干燥器中，接上真空泵抽气，使园片沉于瓶底（也可将园片置于注射器中抽气）。将三角瓶置于30℃温箱中（黑暗）保温30分钟，然后分别取两种溶液各1  ml ,准备测定NO2－含量。

（注意取叶前叶片要进行过一段时间的光合作用。若组织中碳水化合物含量降低使此酶的活性降低。当组织内含糖量低时，可在反应液中加入30μ M  3－磷酸甘油醛或1，6－二磷酸果糖，可显著增加NO2－的产生）。

2．绘制标准曲线：磺胺比色法可测出低于1微克/  ml 的NaNO2含量。在0－5微克/  ml 浓度范围内绘制标准曲线。显色反应的速度与重氮化作用的速度及偶联反应的速度相关，因此受温度、酸碱度等影响，也造成灵敏度的变化，若标准样品与测定样品在相同条件下测定，则显色速度也相同，可以作比较。

吸取不同浓度的NaNO2溶液各1 ml 于试管中，（设置NaNO2溶液处理可为5、4、3、2、1、0微克/  ml ）加入磺胺试剂2  ml 及α－萘胺试剂2 ml ，混合摇匀。在30℃温箱中保温30分钟后立即于比色计上比色，用50号滤光片或在520毫微米波长下读取光密度（或透光率）。以NaNO2浓度为横座标、光密度为纵坐标绘制光密度－浓度标曲线。

3．NO2－含量测定：将吸取的测定样品1 ml 置于一试管中，加入磺胺试剂及α－萘胺试剂各2 ml ，混合摇匀，静止30分钟（于30℃温箱中）后立即比色测定：在520毫微米下读取光密度。对比标准曲线，查出NO2－的含量。然后计算酶活性：以每小时每克鲜重产生的NO2－的微摩尔（μM ）值表示。