磷酸化位点分析实验确定磷酸化氨基酸类型

蛋白样品

了解肽或蛋白质中磷酸化氨基酸的类型，可以限定可能的磷酸化位点，并因此简化(对多肽链中磷酸化残基的确认。磷酸化残基类型通常由磷酸氨基酸分析或磷酸氨基酸特异性免疫检测确定。磷酸氨基酸分析是对肽键进行气相或液相水解，此水解条件下要至少保留一段磷酸酯键完整。 ³²p标记的磷酸蛋白质或磷酸肽的水解产物与磷酸氨基酸标准品混合，并用TLC 分离。未标记的标准品由茚三酮染色检测。32p标记氨基酸由放射自显影检测。蛋白质中存在的磷酸氨基胺类型通过染色标准品与放射标记种类的相关分析确定。如果能得到大量样品．磷酸氨基酸类型可以通过茚三酮染色直接确定。用 2D-PP 图谱上提取的磷酸肽进行磷酸氨基酸分析尤其有用．因为这些肽段通常只含有一种磷酸氨基酸类型。了解磷酸化氨基酸的性质及其他参数，例如肽段分子质量，裂解蛋白质所用的酶的特性，在某些情况下可以鉴定或至少可以推测蛋白质中的磷酸化位点。利用特殊磷酸氨基酸的抗体特异性可以确定地鉴别磷酸化氨基酸的类型，但是这种方法井不能代替磷酸氨基酸分析。酪氨酸磷酸化蛋白质经凝胶分离后很容易通过与酪氨酸磷酸盐抗血清的免疫印记实验检测，抗血清包括 4g10和 py20, 也有如 RC10 一样的细菌片段抗体。