磷酸化位点分析实验磷酸肽的分离——RPHPLC分离磷酸肽

蛋白样品

质谱仪

反相 HPLC 分段收集磷酸肽重现性好，简单，且不需要特殊装备。在 RP-HPLC 中，磷酸肽根据其疏水性被分离。分离后收集的组分经 Cerenkov计数检测。对 Cerenkov计数和时间作图，显示具放射性活性的组分的计数。纯化的磷酸肽用 MS 分析；可用不同的 MS 和 MS/MS 方法。相对于 2D-PP, RP-HPLC 的缺点是高亲水性的磷酸肽不会在柱上停留，而是直接流过柱子。相反，高疏水性的肽直到最高梯度才会被洗脱，甚至不会被洗脱。因此，有可能样品中有些磷酸肽不会被检测到。总体上说， RP-HPLC 的分辨力不如 2D-PP 作图法的分辨力好。需要注意的另一点是磷酸肽会附着在金属表面。因此，如果用标准的金属注射器，会发生明显的样品丢失。使用 RP-HPLC 分析磷酸肽的一个很大的吸引力是 RP-HPLC 系统可以与ESI 质谱方便地在线连接。使用在线连接到 HPLC 系统的质谱仪使样品混合物中磷酸肽的检测和鉴定成为可能，即使分析样品没有被放射性标记也可分析，这需要质谱仪具有特定的扫描功能，如上文所述包括前体离子扫描、中性丢失及源内解离。因此，用 LC/MS 分析磷酸肽适用于非同位素标记样品，在分析人组织中分离的磷酸肽时，具有明显的优势。