磷酸氨基酸分析实验

磷酸化蛋白质

印度墨汁 HCl 磷酸氨基酸混合物 电泳缓冲液 茚三酮

PVDF膜 烘箱 离心机 离心管 纤维素薄层色谱 滤纸 薄层电泳仪

1.  放射性标记的磷酸化蛋白质在SDS-聚丙烯酰胺凝胶上进行制备电泳。电转移至PVDF膜上，用水洗膜数次，不要让膜变干。 

2.  用30~50 ml 印度墨汁染色液染膜5~10 min，轻摇至条带出现。也可在作好放射性或磷光位置标记后，用塑料膜包住膜，进行放射性自显影。 

3.  用干净刀片切下含目的条带的膜，用甲醇将膜重新润湿1 min，再用多于0.5 ml 水的润湿。置于带螺口盖的微量离心管。

4.  加入足够量的6 mol/l HCl，淹没膜，拧紧管盖，在110℃烤箱温育60 min。

5.  自然冷却，高速离心2 min，将液相的水解物移至一个新的微离心管中，真空干燥2 h。

6.  加入6~10 μl 水，在旋涡混合器上剧烈振荡以溶解样品，高速离心5 min。

7.  取25%~50%的样品点样于20 cm×20 cm×100 μm 纤维素薄层色谱板的样品孔。分小份点样，毎次点加0.25~0.5 μl，在每次点加之间，用通过塞有棉花的巴斯德吸管所送出的压缩空气吹干加样点。

8.  取1 μl 非放射性的磷酸氨基酸标准混合物（含磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸和磷酸酪氨酸）点在每个样品之上，如上分次点加，每次0.25~0.5 μl。

9.  在大的玻璃托盘或塑料盒内，用pH1.9电泳缓冲液浸湿大的吸水纸（带4个孔），缓缓倒干多余的缓冲液。将此大吸水纸转移覆盖在已加样的薄层色谱板上，使得色谱板上的4个加样点位干大吸水纸的四个洞的中央，轻压吸水纸以润湿纤锥素和样品，当色谱板均匀润湿后，移去吸水纸。

10.  将薄层色谱板置于电泳装置内，在板的左右两俩0.5 cm 边缘用Whatman 3MM 纸搭接，如果有气泡，将其弄平排出。盖上盖子，开始电泳。在HTLE 7 000电泳仪用双层厚的Whatman 3MM 纸搭接时，载4个样品的薄层板在1.5 KV 电泳20 min。
 

图1 磷酸氨基酸在pH1.9进行第一向电泳分离
 

11.  电泳后，取出薄层板，用电吹风快速吹干20 min（无须加热）。

12.  用pH3.5电泳缓冲液湲湿小的吸水纸，并如步骤10所述以之去均匀润湿薄层色谱板，注意避免将吸水纸放在样品之上。

13.  取去小吸水纸，色谱板逆时计转90^。进行第二向的电泳。如使用HTLE 7 000电泳仪，用pH3.5的电极缓冲液，在1.3 KV 电压下电泳16 min。

14.  电泳后取出簿层板，在50~80℃烤箱内干烤20~30 min 至完全干燥，喷0.25%茚三酮丙酮溶液，再加热5~10 min 使磷酸氨基酸标准品显迹。

15.  在薄层色谱板上加放射性或发磷光的定位标记后，使用增感屏在-70℃自显影，时间从过夜到约10天不等。 

16.  自显影完毕，在透明的投影胶片上描上定位标记和染色显迹的标准磷酸氨基酸的位 置，保留色谱板。即可通过对比投影片和感光片来鉴定出放射活性的磷酸氨基酸。

图2  磷酸氨基酸在pH3.5进行第二向电泳分离


图3  双向电泳分离的放射性自显影模式图