离子交换柱层析(ionexchangechromatography)分离核苷酸

一、目的：
学习离子交换柱层析法分离核苷酸的原理及方法。
二、原理：
离子交换作用一般指在固相和液相之间发生的可逆的离子交换反应，它可用于分离各种可解离的物质。通常离子交换剂是在一种高分子的不溶性母体上引入若干活性基团。这样人工会成的离子交换剂具有各种各样的性能。作为不溶性母体的离分子有树脂、纤维素、葡聚糖、琼脂糖或无机聚合物等，引入的活性基团可以是酸性基团，如强酸型的含有磺酸基（—SO3H）、中强酸型的含磷酸基（—PO3H2）、亚磷酸基（—PO2H）、弱酸型的含有羧基（—COOH）或酚羧基（—OH）等。也可以是碱性基团，如强碱型的含季铵[—N+(CH3)3]、弱碱型的含叔胺[—N(CH3)2]、仲胺（—NHCH3）、伯胺（—NH2）等。
在一定条件下，离子交换树脂吸附的物质数量和在溶液中的物质数量达到平衡时，两者数量之比叫分配系数（平衡常数）。理想的情况是洗脱曲线和分配系数相符合，待分离的各种物质的分配系数，应有足够的差别，以Kd表示分配系数：

式中Ms和Ml分别代表单位重量离子交换树脂和单位体积溶液中溶质的摩尔数。当有A、B两种溶质进行离子交换柱层析时，吸附在离子交换树脂上的溶质为高浓度的竞争性离子所交换并被洗脱下来。溶质的迁移速度与分配系数成反比，因此由原点到A、B两种物质波峰间距离的比值决定于它们分配系数的比值。各波峰的幅度和形状由柱长及其他因素 （如交换树脂颗粒的大小形状、交联度、流速等）所决定。溶质的分配系数不仅与其电荷有关，也受到它与离子交换树脂的非极性亲和力以及两者之间的空间关系等因素的影响。

在一定条件下，离子交换树脂对不同单核苷酸的吸附能力是不同的，因此选择适当类型的离子交换树脂，控制吸附及洗脱的条件便可分离各种单核苷酸。

为了增加单核苷酸在离子交换树脂上的吸附能力，需要：（1）控制条件，使单核苷酸带上大量相应的电荷。这主要是通过调节pH值，使单核苷酸的一些可解离基团（磷酸基、氨基、烯醇基）解离，四种单核苷酸相对分配系数与pH的关系如图14-1。（2）减少上柱溶液中除单核苷酸外的其它离子的强度。洗脱时则相反：使被吸附的单核苷酸的相应电荷降低；增加洗脱液中竞争性的离子的强度，必要时提高温度使离子交换树脂对单核苷酸的非极性吸引作用减弱。
RNA可被碱水解成2＇-或3＇-核苷酸。可利用阳离子交换树脂（聚苯乙烯—二乙烯苯，磺酸型）或阴离子交换树脂（聚苯乙烯—二乙烯苯，季铵碱型）分离单核苷酸。本实验利用强碱型阴离子交换树指（强碱型201×8、强碱型201×7、国产717、Dowex1、Amberlite IRA—400或 Zerolit FF等）将各类核苷酸分开，测定核苷酸的紫外吸收光谱的比值：O．D250/O．D260、 O．D280/O．D260、O．D290/O．D260对照标准比值（表14-1），可以确定其为何种核苷酸，同时也能算出RNA中核苷酸的相对摩尔比。
三、试剂及器材：
1．试剂：
①RNA（酵母RNA，商品）
②强碱型阴离子交换树脂201×8（聚苯乙烯—二乙烯苯、三甲胺季铵碱型，全交换量大于3毫摩尔/克干树脂，100—200目）：用水浸泡并利用浮选法除去细小颗粒，使用时先用0.5mol·L-1氢氧化钠溶液浸泡1小时，以除去碱溶性杂质，然后用无离子水洗至中性。再用1N盐酸浸泡半小时，除去酸溶性杂质，再用无离子水洗至中性，然后用1mol·L-1甲酸钠溶液浸泡，使树脂转变成甲酸型。将树脂装入柱内，继续用1mol·L-1甲酸钠溶液洗，直到流出液中不含氯离子（用1%硝酸银溶液检查）。最后用1mol·L-1甲酸洗，直到260nm处光密度值低于0.020，并用蒸馏水洗至接近中性，即可使用（装置见图14—2）。
③1mol·L-1甲酸：取21.4毫升88%甲酸定容至500毫升。
④1mol·L-1甲酸钠溶液：称34.15克甲酸钠用水溶解定容至500毫升。
⑤0.02mol·L-1甲酸：取10毫升1mol·L-1甲酸定容至500毫升。
⑥0.15mol·L-1甲酸：取75毫升1mol·L-1甲酸定容至 500毫升。
⑦0.01mol·L-1甲酸—0.05mol·L-1甲酸钠溶液（pH4.44）：取5毫升1mol·L-1甲酸、25毫升1mol·L-1甲酸钠溶液定容至500毫升。

⑧0.1mol·L- 1甲酸—0.1mol·L-1甲酸钠溶液（pH3.74）：取50毫升1mol·L-1甲酸、50毫升 1mol·L-1甲酸钠溶液定容至500毫升。
⑨0.3mol·L-1氢氧化钾溶液：取1.68 克氢氧化钾用水溶解定容至100毫升。
⑩2mol·L-1过氯酸：取17毫升70—72%过氯酸定容至100毫升。
111mol·L-1盐酸。
120.5mol·L-1氢氧化钠溶液。
2．器材：
①玻璃柱（内径1.1厘米、高20厘米）。
②下口瓶。
③部份收集器。
④紫外分光光度计。
⑤紫外检测仪。
⑥恒温水浴锅。
四、操作步骤：
1．样品处理：取20毫克酵母RNA，溶于2毫升0.3 mol·L-1氢氧化钾溶液中，于37℃水解20小时，RNA在碱作用下水解成单核苷酸，水解完成后，用2mol·L-1过氯酸溶液高至pH2以下，以4000转/分离心10分钟，取上清液，用 2mol·L-1氢氧化钠溶液调至pH8，并用紫外分光光度计准确测得含量后待用。
2．离子交换柱的安装：取内径1.1 —1.2厘米、高20厘米的玻璃管柱。下端橡皮塞中央插入一玻璃滴管供收集流出液，橡皮塞上盖以尼龙网和薄绢以防止离子交换树脂流出9见图14-2）。
将处理好的强碱型阴离子交换树脂悬浮液一次倒入玻璃柱内，使树脂自由沉降至柱下部，用一小片圆滤纸盖在树脂面上。缓慢放出液体，使液面降至滤纸片下树脂面上。（注意在整个操作过程中防止液面低于树脂，当液面低于树脂表面时空气将进入，在树脂柱内形成气泡，妨碍层析结果）。经沉积后离子交换树脂柱床高7—8 厘米。
3．加样：将RNA水解液小心地用滴管加到离子交换树脂柱上，待样品液面降低到滤纸片内时，用50毫升蒸馏水淋洗树脂柱。碱基、核苷及其他不被阴离子交换树脂吸附的杂质均被洗出。
4、核苷酸混合物的洗脱：收集蒸馏水洗脱液，在紫外分光光度计上测260nm处光密度，待洗脱液不含紫外吸收物质（光密度值低于0.020）时，可用甲酸及甲酸钠溶液进行洗脱。
依次用下列洗脱液分段洗脱，500毫升0.02mol·L-1甲酸；500毫升0.15 mol·L-1甲酸；500毫升0.01mol·L-1甲酸-0.05mol·L-1甲酸钠溶液（pH4.44）；最后用500毫升0.1mol·L-1甲酸-0.1mol·L-1甲酸钠溶液（pH3.74）。用部份收集器收集流出液，控制流速8毫升/10分，8毫升/管。
5、由层析柱所得各部分洗脱液的分析：以相应浓度的甲酸或甲酸钠溶液作为空白对照，用紫外光分光光度计测定各管溶液在260nm波长处光密度值，以洗脱液体积（或管数）为横坐标，光密度值为纵坐标作图，分析各部分的波峰位置（见图14-3）。
五、结果分析：
根据各部分核苷酸在不同波长时光密度的比值（O．D250/O．D260、 O．D280/O．D260、O．D290/O．D260），对照标准比值（见表14-1）以及洗脱时相对位置，确定其为何种核苷酸。由洗脱液的体积和它们在紫外部分的光密度值，计算各种核苷酸的含量（各种核苷酸的摩尔消光系数见表5-1）。
表14-1 部分核苷酸的物理常数。