离心技术在使用Metrizamide梯度分离染色体中的应用

 本文讲述使用Metrizamide梯度分离染色体的方法和步骤。1.         细胞系和组织培养。中国仓鼠卵巢（CHO）和Hela细胞系在McCoy’s培养基中补加10%胎牛血清培养，用碳酸氢盐缓冲系统，需要5%CO₂。2.         细胞同步化。为了在收获时有更多的有丝分裂细胞，用0.06μg/mL乙酰甲基秋水仙碱累积有丝分裂细胞，通常能获得94%~97%中期有丝分裂细胞群。3.         中期染色体分离。分离缓冲液组成为：1.0mol/L 乙二醇（2-甲基-2，4-戊二醇），0.5mmol/L CaCl₂和0.1mmol/L呱嗪-N，N’-双-2-乙磺酸钠（PIPES缓冲液，PH=6.8）。在Parr压力容器里通过25psi（1.7MPa）氮气空化作用破碎细胞。使用区带转子，用10%~50%蔗糖梯度1500g离心30分钟染色体。 用Metrizamide等密度区带法分离染色体步骤如下：1.         用1%二甲基二氯硅烷（溶解在四四♥-♥氯氯♥-♥化化♥-♥碳碳里）把15ml Corex离心管处理5分钟。2.         在60~71.1℃把离心管烤干。3.         把染色体悬液加在染色体缓冲液里（染色体缓冲液：0.75mol/L Metrizamide，5mmol/L NDA），并加到Corex离心管。4.         在染色体悬液上铺放0.35mol/L Metrizamide（溶解在5mmol/L NDA里）。5.         在Sorvall RC-2B离心机、HB-4（甩开吊篮转子）以16300g（10000r/min）离心10分钟。6.         用上取法从顶部收集梯度。按照上述条件离心，染色体漂浮成一个尖锐的区带，粘到离心管壁上的很少，并且大多数染色体是分散的。