离心机分离生物T淋巴细胞的技术介绍

（一）原理 混合单个核细胞悬液在通过尼龙毛柱时，B细胞、浆细胞、单核细胞和一些辅助细胞被选择性粘附于尼龙毛上，而多数T细胞则通过尼龙毛柱，是获得富含T细胞群的有效方法。

（二）材料及试剂

1．尼龙毛（Femwall Laboratories,LP－1 Leukoqak leukocyte Filters）。

2．烧杯、铝箔、漏斗、一次性手套等。

3．装填尼龙毛柱，一次性注射器。

4．取自然沉降的上层血浆，过聚蔗糖—泛影葡胺分层液后，获取的血浆和分层液之间的单个核细胞层。

（三）操作方法

1．尼龙毛的清洗与干燥

（1）戴上已经洗去滑石粉的一次性手套，将尼龙毛（1包或2包，每包35g）放入烧杯中，加入蒸馏水或去离子水，用铝箔盖上烧杯并煮沸约10min。

（2）冷却至常温，倒入漏斗内，使水滴干。

（3）重复（1）、（2）步骤6次。

（4）将尼龙毛摊在铺有纱布的方盘内，37℃温箱干燥2～3天后，贮藏在带盖的方盘内。

2．装尼龙毛柱

（1）取50ml玻璃注射器，拔去注射芯，在注射器头上套一段带夹子的胶管。

（2）将尼龙毛梳理，并适当折叠，以适应注射器的直径，填入注射器内，约20ml的体积。

（3）将填好尼龙毛的注射器连同注射器芯一起包好，高压灭菌。

3．用离心机细胞分离

（1）将注射器固定在支架上，倒入37℃的细胞培养液，关闭阀门一定时间，然后打开阀门，放掉细胞培养液，以清洗几次尼龙毛，关上阀门。

（2）将要分离的细胞液用预先加温的培养液稀释成适当的浓度，约5.00×107个细胞／ml。

（3）将细胞液倒入注射器内，使之没过尼龙毛柱。盖上注射器，37℃温育45min 至1h。

（4）打开下口，缓慢放流（1滴／min），收集于离心管中。 （5）离心，即获所需的T淋巴细胞。

（6）关闭注射器下口，于注射器内加入0.85％冰冷生理盐水，振荡，并套上注射器芯，打开下口，使劲推出注射器内液体，即获得粘附于尼龙毛上的B淋巴细胞、浆细胞、巨噬细胞等。

（四）注意事项

1．此种分离法，T淋巴细胞也常有一部分被吸附，吸附的多少与尼龙毛的质量有关，与装柱的松紧也有关系。

2．此法的T淋巴细胞的回收率约20％～30％。

3．用过的尼龙毛可回收，以盐水洗涤，然后浸入0.1Mol/L的HCl中过夜，然后再同前法清洗。 单核细胞分离技术

（一）铁粉吸附法

1．材料及试剂

（1）铁粉或羰基铁粉（Atomergic chemetals）99％的纯度，颗粒小于60µm（Goodfellow Metals）。

（2）强磁铁（马蹄形）。

（3）一块小棒状磁铁（约1cm长）。

（4）毛细吸管等。

2．操作方法

（1）称取一定量的铁粉，一般为10g，用100ml生理盐水洗涤4次，去除任何可溶性有毒物质。在倒去盐水时，用强磁铁吸住铁粉。

（2）用50ml生理盐水混悬铁粉。摇匀后，分装于10个瓶中，包扎瓶口，121℃灭菌20min，拿出后立即轻轻摇匀，防止铁粉结块，储藏备用。

（3）临用前，倒去瓶中的生理盐水，加入适量的单个核细胞悬液（3ml～5ml，细胞总数为8×107个／瓶）。37℃温育45min，中间不时晃动，使铁粉悬浮起来。

（4）加入一块小磁铁棒于瓶中，让其吸住铁粉以及附着在铁粉上的细胞。

（5）倒出悬液，此悬液主要是淋巴细胞，离心，收集。

（6）在铁粉瓶内倒入一定量的Hank’s液，用力振摇后，以强磁铁吸附，几分钟后，倒出液体。

（7）2 000r/min离心液体，管底即为单核细胞。

（二）玻璃板吸附法 将分离的单个核细胞倾于无菌洁净的玻璃平皿内，置37℃ 30 min～40min，用毛细吸管轻轻吸取悬液，即为淋巴细胞。用适量的Hank’s液冲洗平皿，收获即为单核细胞悬液。