第二章：4分钟教你学会多重PCR引物设计

多元 PCR (多重PCR，Multiplex PCR，MPCR) 是指在一个 PCR 反应中使用一个模板和几对引物同时扩增多个目的片段的 PCR 反应。这项技术非常有用，他不仅可以提高 PCR 的产率还能提高 DNA 样品的利用率。

另一种形式的 MPCR 是组合 PCR, 组合 PCR 是在同一 PCR 反应中使用几个不同的模板和几对引物。多元 PCR 和组合 PCR 往往被当作同义词使用。

设计策略

MPCR 要求所有的引物对在同一条件下扩增其各自的特异序列。大多数多元 PCR 反应 局限于扩增 5~10 个目的片段，原因之一是反应中，每另加入一对引物会导致一定程度的灵活性的丢失。引物数量的增加也使引物二聚体和非特异扩增出现的概率增加。因此，进行多元 PCR 要求周密计划，且需多次尝试，使反应条件优化。

理论上，一个多元反应中，所有引物扩增其特异序列的效率应该是一样的，但通常是很难预测一对引物的效率。在相似条件下，退火温度几乎相同的寡核苷酸可更好地工作。

多元 PCR 引物设计和优化的一般规律

当设计 MPCR 引物时，除了引物设计的一般规律外，其他一些因素也必须考虑。一般 来说，一个多元反应中使用的所有引物的 Tm 值应该接近，要避免 3'-核苷酸互补，每一对引物应独立地优化其反应条件。一旦将引物集中，需按顺序混合，然后再进行优化。

1. 引物长度应为 18~24 个碱基，较长的引物更容易形成引物二聚体。

2. 对于 MPCR，退火温度和循环数非常关键。要尽可能提髙退火温度，要确认每一对 引物单独扩增时的退火温度，然后在多元 PCR 反应时采用最低的退火温度。同样，要采用最少的扩增数。

3. 由于多个模板同时扩增，酶量和核苷酸浓度可能成为限制因子，而且完全合成所有 产物所需的时间增加。因此，优化每个反应的试剂浓度和延伸时间就显得非常重要。相对于 单个目的序列的 PCR 而言，多元 PCR 所需延伸时间较长。