简并寡核苷酸诱变实验

大肠杆菌

DNA聚合酶dNTP甘油NaClEDTASDS无水乙醇

水浴锅离心机分光光度计

1.  设计寡核苷酸，其3‘端含有由8个核苷酸组成的回文结构，且包含某一限制性内切酶的识别位点；如果可能的话，5’端也应有一含某个限制性内切酶位点的序列。中间区段则应含目的诱变区。
 

图一、简并寡核苷酸的设计

2.  寡核苷酸的合成。在无需突变的位置时，用一种核苷酸前体的同质溶液进行合成，而在需要突变的位置时，则用特定的核苷酸前体混合物来控制合成反应的进行。

3.  通过HPLC和（或）含7 mol/l 尿素的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化每核苷酸，用水调整浓度至1 mg/ml。

4.  取200 pmol （1~2 μg）寡核苷酸加至一个500 μl 的微量离心管中，加水至7 μl 温育5 min。

5.  加1 μl 10×DNA聚合酶1缓冲液，降温至适合3‘端回文结构杂交的温度，保温不少于60 min。

6.  加2 μl 2.5 mmol/l 4种dNTP混合液，5 U klenow酶，再加10 μCi的任意一种［α-³²P］，23℃保温1 h。另加入5 U的klenow酶继续温育2 h或过夜。

7.  加1 μl 0.5 mol/l EDTA终止反应，加TE缓冲液至总体积为50 μl，加乙酸钠至终浓度为0.3 mol/l。用缓冲液平衡酚抽提，无水乙醇沉淀DNA。DNA重悬于20 μl TE缓冲液。取出2 μl 留待作变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析之用。
 

8.  在30 μl 反应体积内，每微克塞核苷联用10~40 U 的识别外侧限制性酶切位点的酶消化双链寡核苷酸2 h 以上，如寡核苷酸5’端无限制性内切酶位点，则用识别内侧限制性内切酶位点的酶切割。

9.  取出2 μl 留待作变性聚丙烯酰胺凝胶电泳之用，余下的用缓冲液平衡酚抽提，无水乙醇沉淀，在重悬于不少于10 μl 的TE缓冲液，然后用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化。

10.  切下双链DNA所在的胶，并用凝胶洗脱缓冲液将其洗脱出来，用20 μl 的TE缓冲液重悬，贮存于-20℃。

11.  用识别内侧酶切位点（位于原来的寡核苷酸的3’端）的限制性内切酶消化双链寡核苷酸，以生成一同源双链寡核苷酸混合物，其5’和3’端适于将它们连接进常规的的载体中去。取留待作变性聚丙烯酰胺凝胶电泳之用，剩余的用酚抽提， 乙醇沉淀，重悬于20 μl  缓冲液。

12.  步驟7、9、11中留取的2 μl 液体用变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，以证实各步反应均产生了所要的产物。

13.  按系列稀释法用TE缓冲液从10到10 000倍系列稀释双链寡核苷酜，设置一系列的连接反应，每个反应均含有恒量的载体和部分上述稀释液。

14.  用常规的转化方法将连接反应物转化进适当的大肠杆菌。通过限制性内切酶酶切和DNA序列测定来分析所得的DNA。