“70万一针”寡核苷酸药进医保，此类药物分析您知道吗？

　2021年12月3日，国家医疗保障局召开新闻发布会公布2021年国家医保药品目录调整结果，于2022年1月1日正式执行。治疗罕见病脊髓性肌萎缩症（SMA）的药物诺西那生钠注射液被纳入医保，价格从曾经的70万一针降至3.3万，为患者及其家庭带来福音。SMA是一种罕见的遗传性神经肌肉疾病，是由于SMN1基因突变或缺失，造成与运动神经元密切相关的SMN蛋白缺乏，导致肌肉萎缩，大部分患者因为呼吸衰竭而死亡。诺西那生钠的有效成分是一种反义寡核苷酸，可以改变SMN2前mRNA的剪接，增加完整长度SMN蛋白的产生，达到治病的目的。

什么是寡核苷酸药物？

　　寡核苷酸药物通常指由人工合成的长度50个以内核苷酸组成的一类药物，包含单链或双链DNA或RNA。目前研究较多的是反义寡核苷酸药物（ASO）和小干扰RNA药物(siRNA)。与小分子药物和单抗药物靶向蛋白质不同，寡核苷酸药物通常靶向mRNA，从转录后水平进行治疗，具有特异性好、有效性高和长效性突出的优势。

寡核苷酸药物分析和表征

　　为了保证产品的安全性和有效性，寡核苷酸药物通常需要从分子量、碱基序列、解链温度Tm、产品纯度、有关物质等方面进行分析，需要使用质谱、生物惰性液相色谱、紫外分光光度计等仪器，岛津公司开发了一系列的解决方案，供您参考。

　　分子量表征

　　寡核苷酸药物通常使用固相亚磷酰胺化学法进行合成，亚磷酰胺单体是合成的关键原料。寡核苷酸药物的分子量则是其重要的产品属性。因此，检测寡核苷酸药物及其合成用原料亚磷酰胺单体的分子量是常用的质量控制手段。常用的分子量检测方法是质谱法。岛津质谱产品四极杆飞行时间质谱仪（LCMS-9030）、单四极杆质谱仪（LCMS-2050）和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-8030）都是寡核苷酸药物及其原料分子量表征的常用仪器。下面就为大家带来QTOF LCMS-9030测定寡核苷酸药物精确分子量和MALDI-8030测定亚磷酰胺单体分子量的精彩案例。

　　l  LCMS-9030分析寡核苷酸药物分子量

　　岛津四极杆飞行时间质谱 LCMS-9030具有高分辨率、高质量数准确度和媲美三重四极杆灵敏度的特点，可以准确测定寡核苷酸分子量。寡核苷酸分子带负电，通常使用ESI负离子模式检测，在质谱图上常观测到一系列的多电荷离子，需要进行解卷积处理，得到寡核苷酸分子量。

LCMS-9030结合Insight Explore CSD分析结果

寡核苷酸药物序列: 5'-mG-mC*-mC*-mU*-mC*-dA-dG-dT-dC*-dT-dG-dC*-dT-dT-dC*-mG-mC*-mA-mC*-mC*-3'

理论单同位素分子量：6431.7239

　　采用QTOF LCMS-9030采集一个长度为20 mer的寡核苷酸药物的高分辨质谱图，使用Insight Explore CSD进行解卷积处理，得到实测单同位素分子量为6431.7236，质量数偏差为0.05 ppm。

　　l  MALDI-8030分析亚磷酰胺单体的分子量

　　采用MALDI-8030测定了四种亚磷酰胺单体的分子量，在线性正离子模式下，均检测到显著质谱峰，质荷比大小与钾离子加合峰相符。MALDI-8030体积紧凑、分析速度快、维护方便，是寡核苷酸样品分析的有力工具。

　　序列确认

　　寡核苷酸的序列同设计序列一致，是保证药物有效性的重要方面。采用MALDI-8030测定了长度为20 mer的一种寡核苷酸的分子量和碱基序列。寡核苷酸的MADLI-TOF质谱图主要以单电荷和双电荷形式存在，可直接读出分子量，操作简单，结果直观。利用源内裂解技术（ISD），寡核苷酸更倾向于形成w型碎裂离子，碎裂离子谱图更简单。通过比对这些碎片离子信息，可以较容易地读出核酸序列。

寡核苷酸MALDI-ISD-TOF质谱图和碎裂离子

　　解链温度（Tm）

　　随着温度升高，双链核酸分子的双链结构开始打开，最终变成两条单链的结构。Tm是双链核酸分子双链结构解开一半时的温度，是双链核酸分子结构稳定性的重要指标。使用岛津UV Tm分析系统可以非常方便地测定双链核酸分子的Tm。该系统由紫外分光光度计、电热温度控制单元和Tm分析软件组成。Tm分析软件可以控制温度控制单元准确控温，升温速率12档可调，可满足双链核酸分子解链曲线的连续测定。Tm分析软件还可以自动分析解链曲线，给出准确的Tm数值。

UV Tm分析系统组成（左）和核酸样品Tm分析结果（右）

　　纯度分析

　　使用生物惰性液相Nexera XS Inert结合Shim-pack Scepter C18色谱柱进行了寡核苷酸样品的快速纯度分析，寡核苷酸和其杂质分离良好。即使在50℃高温、0.1M TEAA的盐浓度条件下分析，也表现出良好的稳定性。基于有机杂化颗粒硅胶技术的Shim-pack Scepter C18，适合用于寡核苷酸纯度以及杂质分析。

12 mer寡核苷酸样品纯度分析UHPLC色谱图

　　递送介质分析

　　递送介质是将核酸药物递送至靶组织，穿透细胞膜，进入细胞内部发挥药效的关键。脂质纳米粒（LNP）和聚乙烯亚胺（PEI）都是核酸药物的常用递送介质。LNP通常包含阳离子脂质、胆固醇、PEG修饰脂质和辅助性中性脂质，四种成分协同作用，将寡核苷酸包裹并递送到细胞内发挥作用。PEI是一种水溶性高分子聚合物，携带大量正电荷，可通过静电作用结合核酸药物，将其递送至细胞内，并保护其免受核酸酶降解。递送介质的含量检测对寡核苷酸药物给药方式、药学研究等具有重要意义。

　　利用岛津生物惰性液相系统结合蒸发光散射检测器ELSD-LT III建立了定量分析LNP中四种成分含量，以及PEI含量的分析方法。

结语

　　天价寡核苷酸药物首进医保，使得这类药物在近期迅速刷屏，备受关注。对寡核苷酸药物进行分析和表征，可以更好地保证产品的药效和安全性。基于岛津丰富的分析仪器产品线，我们利用QTOF LCMS-9030、单四极杆质谱LCMS-2050、MALDI TOF质谱、UHPLC、UV Tm分析系统等技术平台，开发了分子量表征、核苷酸序列确认、Tm测定、纯度分析和递送介质分析的方法，助力寡核苷酸药物研发和质控，希望未来开发出更多更好的药物，造福患者。