糖基转移酶的小分子抑制剂编辑氮连接连接糖基化位点

　　蛋白质的N连接的糖基化是一种重要的蛋白翻译后修饰，对蛋白质的折叠、稳定性和生理功能均起着重要的作用。N连接糖基化修饰主要是通过糖基转移酶（OST）将寡糖逐渐转移到蛋白质中的NXT/S (X≠P) 序列上的天冬酰胺上。OST含有两个独立编码的催化亚基，分别为SST3A和STT3B。SST3A负责大部分序列位点和共翻译过程中的糖基化修饰，STT3B负责负责小部分序列位点和后翻译过程中的糖基化修饰，或者STT3A遗漏的位点的糖基化。过去45年来研究糖基化的功能主要是衣霉素，这种高毒性天然产物能够几乎抑制所有的N连接糖基化。近年来，作者通过高通量筛选出来一种的新的OST的小分子抑制剂NGI-1，并且没有衣霉素抑制剂带来的细胞毒性，且更倾向对SST3B抑制。因此作者想设计出来一系列的NGI-1类似物来实现蛋白质糖基化位点的选择性修饰。

　　NGI-1小分子抑制剂对SST3A和STT3B抑制效果

　　作者首先研究了NGI-1系列类似小分子抑制剂对SST3A和STT3B催化亚基分别的抑制效果。作者首先采用CRISPR/Cas9技术在HEK293和Huh7细胞中构建了分别敲除SST3A和SST3B的细胞系SST3A-ko和SST3B-ko。随后通过ERLucT 报告基团来测试体系的N-连接糖基化水平，它它是由内质网信号肽和荧光素酶基因序列构成。当荧光素酶上有三个N连接糖基化位点，当糖基化作用被抑制时，荧光素酶的活性会增加，随后通过检测荧光强度来反映糖基化水平。NGI-1对SST3A和STT3B均能产生部分抑制且更倾向抑制SST3A，随后在Huh7细胞中的热转移分析证明了活性的丢失和多肽结合位点的突变均不会干扰NGI-1和OST催化亚基的相互作用。随后作者测试了一系列类似NGI-1小分子对HEK293细胞系SST3A-ko和SST3B-ko中在10 uM处理24小时后的糖基化水平，发现不同小分子对SST3A的抑制能力存在差别。为了克服ERLucT 报告基团上荧光素酶糖基化位点对催化活性可能的影响，作者又选择构建了ERHalo3N报告基团，随后可以通过蛋白免疫印迹检测33 Kda的HaloN蛋白，结果发现与荧光素酶蛋白不同，NGI-1不能完全的抑制SST3B对HaloN蛋白糖基化作用。通过17种NGI-1类似小分子抑制剂在这两个模型种分别对SST3A和STT3B催化亚基的抑制作用，发现存在部分化合物能特异性的分别抑制两种催化亚基。

　　作者随后研究分析NGI-1类似小分子抑制剂与OST亚基之间的构效关系来寻找STT3B特异性的抑制剂。STT3B对NGI-1类似小分子抑制剂的容忍性要优于STT3A。大部分在三个取代位置R1，R2，R3含有杂环化合物均能强地抑制STT3B的催化活性，而在R1位置的氮杂环对STT3A的催化活性至关重要。作者进一步将R1位置的叔胺改为反向酰胺键，并分别连接甲基噻唑（C18）和苯基（C19），在ERHalo3N报告基团体系中测试对SST3A和STT3B抑制作用。发现C18 能部分抑制STT3A的活性，而C19对STT3A没有抑制作用。作者随后进一步测试不同时间点和浓度下对NGI-1C2, C4, 和C19 对STT3B抑制效果，发现化合物C19是一种专一抑制STT3B的小分子抑制剂。

　　 作者最后在细胞中验证了通过SST3A和STT3B的糖基化功能来调节蛋白质的功能和这些小分子抑制剂对未折叠蛋白反应（UPR）的激活。EGFR是高度糖基化络氨酸激酶受体，测试其在系列抑制剂下分在SST3A-ko和SST3B-ko中的蛋白表达量和激酶激活功能。发现在SST3A-ko中，C19能通过选择性的抑制STT3B催化活性，来降低EGFR受体的激活，而在SST3B-ko中，C19不能降低EGFR的糖基化和受体激活水平。同样地，作者还测试了STT3A 和STT3B分别对环氧酶2（COX2 ，前列腺素合成中的限速酶）的糖基化的贡献。结果发现抑制OST中的STT3B催化亚基活性能选择性的降低COX2的糖基化水平，并且增加COX2的稳定性和反应活性。糖基化的蛋白需要正确的折叠和转运，未正确折叠蛋白会激活UPR。作者测试了这些小分子抑制剂对UPR的影响，包括分析BiP的诱导和XBP1 mRNA剪切。相比传统衣霉素,C19没有激活UPR，并且膜穿透实验证明这些抑制剂有更小的细胞毒性。

　　 总结：作者报道开发了一系列针对糖基转移酶的SST3A和STT3B两个催化亚基特异性的小分子抑制剂，调节蛋白质的糖基化水平来影响蛋白的功能。