纯化DNA实验

细胞

TBS 抽提缓冲液

离心管

1. 根据样品类型，从下列方法中选一个作为步骤 1 进行操作。

(1) 细胞样品

① 单层培养的细胞

以用冰预冷的 TBS 将单层细胞洗涤 2 次，用刮棒把细胞刮入约 0.5 ml 的 TBS 中，将细胞悬液转移到冰浴的离心管中，用 1 ml TBS 冲洗培养皿，并入离心管中的细胞悬液。于 4℃ 以 1500 g 离心 10 分钟以收获细胞。用 5~10 倍体积经冰预冷的 TBS 重悬细胞并再度离心。用 TE ( pH 8.0）重悬细胞，使细胞密度为 5x10⁷ 细胞/ml，转移至一个三角烧瓶中（1 ml 细胞悬液用 50 ml 烧瓶；2 ml 则用 100 ml 烧瓶；余类推）。每毫升细胞悬液加入 10 ml 抽提缓冲液，在 37℃ 孵育 1 小时，随后进行步骤 2。

抽提缓冲液：

10 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0

0.1 mol/L EDTA，pH 8.0

20 ug/ml 胰 RNA 酶

0.5% SDS

② 悬浮生长的细胞

于 4℃ 以 1500 g 离心 10 分钟以收获细胞。用与原培养液等体积的经过冰预冷的 TBS 重悬细胞，再次离心收获细胞并重复洗涤步骤。用 pH 8.0 的 TE 重悬细胞使密度为 5x10⁷ 细胞/ml。将悬液转移至大小适当的烧瓶中，依前听述加入抽提缓冲液并孵育。

(2) 组织标本

将刚切制的组织碎块放到盛有液氮的 Waring 绞切器的不锈钢杯中，以最高速度绞切至组织粉碎成为粉末。待液氮蒸发，将组织碎末一点一点地加入到盛有近 10 倍体积抽提缓冲液（如前）的烧杯中。使粉末分散在抽提缓冲液的表面，面后振摇烧杯使粉末浸没。待其完全分散于溶液中后，将该溶液转移至 50 ml 离心管中，37℃ 孵育 1 小时。随后进行步骤 2。

(3) 血液标本

收集约 20 ml 新鲜血液，加入装有 3.5 ml 酸性柠檬酸葡萄糖溶液 B ( ACD ) 的试管中 。这一抗凝剂优于 EDTA，因为它在血液贮存过程中更能保存高分子量 DNA。这些血液在制备 DNA 前可于 0℃ 保存数天或于 -70℃ 长期保存。配制 ACD 时，混合：

柠檬酸              0.48 g

柠檬酸钠          1.32 g

葡萄糖             1.47 g

加水至 100 ml

用作抗凝剂时，每 6 ml 新鲜血液中加入 1 ml ACD。

新鲜血液（20 ml）：以 1300 g 离心 15 分钟，弃上层血浆，用巴斯德吸管将淡黄层小心移到另一管中并再次离心。淡黄层即为密度不均一的白细胞宽带。将经第二次离心的淡黄层重悬于 15 ml 抽提缓冲液中，37℃ 孵育 1 小时，随后进行步骤 2。

冻藏血液（20 ml）：在室温水浴中融化，移至离心管中，用等体积 PBS 稀释；随后于室温以 3500 g 离心 15 分钟并弃去上清液，其中含有已溶解的红细胞用 15 ml 抽提缓冲液重悬沉淀物；37℃ 孵育 1 小时，随后进行步骤 2。

2. 蛋白酶 K 至终浓度为 100 ug/ml，用玻棒温和地将酶混入黏稠的溶液中。

3. 裂解细胞的悬液置于 50℃ 水浴中 3 小时，不时悬动该黏稠溶液。

4. 溶液冷却至室温，如有必要就将溶液倒入离心管。加等体积经 0.5 mol/L Tris-HCl（pH 8.0）平衡的酚，缓慢地来回颠倒离心管 10 分钟以轻轻地混合两相 。如此时两相未能混合形成乳浊液，则将离心管置于旋转器上 1 小时，于室温以 5000 g 离心 15 分钟，使两相分开。

5. 大口径移液管（出口直径为 0.3 cm ) 将黏稠的水相移至一洁净的离心管中并用酚重复抽提 2 次。

6. 分离高分子量 DNA ( 约 200 kb )：第三次酚抽提后用全部水相于 4℃ 对 4 L 50 mmol/L Tris-HCl ( pH 8.0)、10 mmol/L EDTA ( pH 8.0 ) 溶液透析 4 次，直至透析液的 OD₂₇₀ 值小于 0.05。让透析袋留有使样品体积增至 1.5~2.0 倍体积的空间。下转步骤7。

分离大小为 100~150 kb 的 DNA：第三次酚抽提后，将全部水相移至另一离心管中并加 0.2 倍体积的 10 mol/L 乙酸铵。在室温下加 2 倍体积乙醇并转动离心管使溶液充分混合。DNA 立即形成沉淀，通常可用制成 U 形并经封口的巴斯德吸管将沉淀从乙醇溶液中移出。而大部分污染的寡聚核糖核苷酸仍留在乙醇溶液中。如果 DNA 沉淀成为碎片，则在吊桶式转头中于室温以 5000 g 离心 5 分钟收集 DNA。用 70% 乙醇洗涤 DNA 沉淀 2 次，并按上述条件离心收集 DNA。尽可能彻底地除去 70% 乙醇，于室温将 DNA 沉淀置于一个敞幵的管内，直至可见的痕量乙醇挥发殆尽。不要使 DNA 沉淀完全干燥，否则极难溶解。

大约按每 5x10⁶ 细胞加 1 ml TE (pH 8.0 )。将管子放在摇床平台上慢慢摇动直至 DNA 完全溶解。这通常需要 12~24 小时。

7. 测定 DNA 样品在 260 nm 和 280 nm 处的光吸收。A₂₆₀ 与 A₂₈₀ 之比应大于 1.75。低于此值则表明制备物中留有大量蛋白质。在这种情况下，应加入 SDS 至终浓度为 0.5%，并重复步骤 2~7。

8. 计算 DNA 浓度，进行脉冲电场凝胶电泳或通过铺在 1% 琼脂糖支持层上的 0.3% 琼脂糖凝胶电泳分析小量样品。大于 100 kb 的 DNA，其迁移率应该比完整的 λ 噬菌体 DNA 的线性二聚体分子慢。将 DNA 贮存在 4℃。

参考《细胞实验指南》第3章