线粒体分离实验

细胞

RSB MS 缓冲液

Dounce 匀浆器

1. 用 11 ml 冰上预冷过的 RSB 重新悬浮细胞，转移到一个 15 ml 的 Dounce 匀浆器中

RSB（使组织培养细胞膨胀的低渗缓冲液）

10 mmol/L NaCl

2.5 mol/L MgCl₂

10 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5

2. 让细胞膨胀 5~10 分钟。用相差显微镜监测膨胀过程。

3. 用研杵 B ( 小间隙型）研磨几下使膨胀细胞破碎。

4. 立刻加入 8 ml 2.5x MS 缓冲液至终浓度为 1x MS。用封口膜封住匀浆器顶端，倒转数次使溶液混匀（如果要进行标志酶检测，还要留下部分匀浆 )。

2.5 x MS 缓冲液：

525 mmol/L 甘露醇

175 mmol/L 蔗糖

12.5 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5

2.5 mmol/L EDTA，pH 7.5

1 x MS 缓冲液：

210 mmol/L 甘露醇

70 mmol/L 蔗糖

5 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5

1 mmol/L EDTA，pH 7.5

5. 将匀浆转至离心管中进行差速离心。用少量 MS 清洗匀浆器并将清洗液加入匀浆中，用 MS 缓冲液将体积加至 30 ml。

6. 匀浆在 1300 g 离心 5 分钟以去除细胞核、未破碎的细胞和大的膜碎片。

7. 将上清倒在一个干净的离心管中。

8. 重复“沉淀细胞核”步骤两次。

9. 将上清移至一干净离心管中，17000 g 离心 15 分钟沉淀线粒体。

10. 弃去上清，用 Kimwipe 吸干离心管内表面。

11. 1X MS 重悬浮沉淀以漂洗线粒体，重复 17000 g 离心步骤。

12. 弃上上清，用适合后续工作的缓冲液重悬浮沉淀。