线粒体的超活染色与观察

实验简介：线粒体是机体能量代谢的重要细胞器。本实验以肝细胞、人口腔上皮细胞、洋葱鳞茎内表皮细胞三种材料为实验对象，通过詹纳斯绿B 专一性地对线粒体进行超活染色，可使线粒体内中的细胞色素氧化酶系呈蓝绿色反应，而线粒体周围的细胞质呈无色反应，由此作为线粒体的特异性特征。实验学时3 个。

一、实验目的
1. 观察动、植物活细胞内线粒体的形态、数量与分布。
2. 学习一些细胞器的超活染色技术。

二、实验原理
活体染色是指对生活有机体的细胞或组织某些结构能着色但又不影响细胞的生命活动和产生任何物理化学变化以致引起细胞的死亡的一种染色方法。因此活染技术通常可用来研究生活状态下的细胞形态结构和生理、病理状态。根据所用染色剂的性质和染色方法的不同，通常把活体染色分为体内活染与体外活染两类。体内活染是以胶体状的染料溶液注入动、植物体内，染料的胶粒固定、堆积在细胞内某些特殊结构里，达到易于识别的目的。体外活染又称超活染色，它是由活的动、植物分离出部分细胞或组织小块，以染料溶液浸染，染料被选择固定在活细胞的某种结构上而显色。
詹纳斯绿B 是毒性较小的碱性染料，可专一性地对线粒体进行超活染色，这是由于线粒体内的细胞色素氧化酶系的作用，使染料始终保持氧化状态(即有色状态)，呈蓝绿色；而线粒体周围的细胞质中，这些染料被还原为无色的色基(即无色状态)。

三、实验材料
（一）材料 肝细胞、人口腔上皮细胞、洋葱鳞茎内表皮细胞
（二）器材 显微镜、恒温水浴锅、解剖盘、剪刀、表面皿、吸管、牙签、吸水纸。

（三）试剂
1．Ringer 溶液
NaCl 0.85g
KCl 0.25g
CaCl2 0.03g
蒸馏水 100ml
2. 1%詹纳斯绿B 溶液（原液）
称取50mg 詹纳斯绿B 溶于5ml Ringer，稍加微热(30～40℃)，使之溶解，用滤纸过滤后，即为1％原液。
3. 詹纳斯绿B 溶液（应用液）
取1％原液1ml 加入49ml Ringer 溶液, 混匀即可。现用现配。

四、实验操作
1. 人口腔粘膜上皮细胞线粒体的超活染色观察
(1) 取清洁载玻片放在37℃恒温水浴锅的金属板上，滴2 滴詹纳斯绿B 应用染液。
(2) 实验者用牙签宽头在自己口腔粘膜处稍用力刮取上皮细胞，将刮下的粘液状物放入载玻片的染液滴中，染色10～15min(注意不可使染液干燥，必要时可再加滴染液)，盖上盖玻片，用吸水纸吸去四周溢出的染液，置显微镜下观察。
(3) 在低倍镜下，选择平展的口腔上皮细胞，换高倍镜或油镜进行观察。
可见扁平状上皮细胞的核周围胞质中，分布着一些被染或蓝绿色的颗粒状或短棒状的结构，即是线粒体。
2. 小白鼠肝细胞线粒体的超活染色观察
(1) 用脊椎脱臼法处死小白鼠，置于解剖盘中，剪开腹腔，取小白鼠肝边缘较薄的肝组织块，放入表面皿内。用吸管吸取Ringer 液，反复浸泡冲洗肝脏，洗去血液。
(2) 在干净的凹面载玻片的凹穴中, 滴加詹纳绿B 应用液，再将肝组织块移入染液，注意不可将组织块完全淹没，要使组织块上面部分半露在染液外，这样细胞内的线粒体表面可充分得到氧化，易被染色。当组织块边缘被染成蓝绿色即成(—般需染20～30min)。

(3) 吸去染液，滴加Ringer 溶液，用眼科剪将组织块着色部分剪碎，使细胞或细胞群散出。然后，用吸管吸取分离出的细胞悬液，滴一滴子载玻片上，盖上盖玻片进行观察。
(4) 在低倍镜下选择不重叠的肝细胞，在高倍镜或油镜下观察，可见具有l～2 个核的肝细胞质中，有许多被染成蓝绿色的线粒体，注意其形态和分布状况。
3. 洋葱鳞茎表皮细胞线粒中的超活染色观察
(1) 用吸管吸取詹纳斯绿B 应用染液，滴一滴于干净的载破片上，然后撕取一小片洋葱鳞茎内表皮，置于染液中，染色10～15min。
(2) 用吸管吸去染液，加—滴Ringer 液，注意使内表皮组织展平，盖上盖玻片进行观察。
(3) 在高倍镜下，可见洋葱表皮细胞中央被一大液泡所占据、细胞核被挤至—侧细胞壁处。细观察细胞质中线粒体的形态与分布。