细胞和亚细胞提取物的制备实验

合适的动物组织

二硫苏糖醇 匀浆缓冲液A 匀浆缓冲液B 苯甲基磺酰氟

离心机 粗棉布和过滤漏斗 切刀或绞肉机 匀浆均化器

要点：所有操作均在 0~4°C 进行。

1.从动物中取出组织后，修剪并去除脂类和结缔组织，然后放入预冷的匀浆缓冲液 A 中。

2.用切刀把洗好的组织切成小块（如 1cm 方块），或者把这些组织放在绞肉机上搅两次。

像肝脏、大脑、肾和心脏等组织很容易在韦林搅切器中破碎，但是骨骼肌和肺则很难，所以应在勻浆之前先用家用绞肉机来绞碎。许多纤维组织，比如哺乳动物胸腺，必须在匀浆之前冰冻以利于破碎（常用 Ultra-Turrex 勻浆器）。培养的哺乳动物细胞和少量的软组织（1~5 g)，比如脑，可以使用 Dunce 手动勻架器（Dignam,1990) 来勻浆。在所有情况下，都要 4°C 预冷匀浆器和玻璃容器，并且匀浆操作应该在冷室中进行。

3.将组织加入 3~4 倍体积的匀浆缓冲液 B 中，然后转移到匀浆器中。

4.使用下面的方法来制备匀浆液。

Potter-Elvehjem 勻浆器：仪器设置在 500~1500r/min，勻浆组织数次，每次 5~10s。

Dounce 手动匀浆器：匀浆组织 10~20 次。

韦林搅切器：匀浆组织 3~4 次，每次 20~30s，间隔 10~15s。

5.把匀浆液倒入玻璃烧杯，把烧杯放在冰上，在 4°C 条件下温和搅动匀浆液 30~60 min，以便充分提取蛋白。

实验提示：匀浆过程中不要起泡。

6.4°C 条件下 10000g 离心 10~20 min，除去匀浆液中的细胞碎片和其他物质。

7.过滤漏斗中铺两层纱布（或加一层玻璃棉）来过滤上清，除去漂浮在表面的脂类物质。小心地拧纱布以便获得最大量的滤液（称为「粗提液」）。

8.尽快用适当的分离方法和分析方法处理样品。