细胞凋亡与坏死的区别和实验观测（三）

3.电子显微镜

虽然光学显微镜下可以看见胞膜起泡现象和凋亡小体,但凋亡细胞的形态学变化大多发生在超微结构,因此用光镜观察难以令人满意,而透射电镜可清楚地观察到细胞结构在凋亡不同时期的变化。电镜形态学观察是迄今为止判断凋亡最经典、最可靠的方法,被认为是确定细胞凋亡的金标准。

检测方法：

透射电镜标本经戊二醛和饿酸双重固定，丙酮脱水，环氧树脂包埋，超薄切片，醋酸枸椽酸电子又重染色，透射电镜观察。扫描电镜标本经戊二醛和饿酸双重固定，乙醇逐级脱水，CO2临界点干燥，真空喷金，扫描电镜观察。

结果评判: 

可见凋亡细胞表面微绒毛消失，核染色质固缩、边集，常呈新月形，核膜皱褶，胞质紧实，细胞器集中，胞膜起泡或出“芽”及凋亡小体和凋亡小体被临近巨噬细胞吞噬现象。

缺点：

1）只能定性,不能定量;

2）标本处理过程复杂,设备相对昂贵,对检查者的技术水平要求较高,不适于大批标本检测;

3）在组织切片上进行电镜观察时,有时凋亡很难与正常细胞有丝分裂相鉴别,因为两种情况下都可出现染色质浓聚。如同时进行荧光染色,可弥补电镜检查的不足。

质出现浓缩状态；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；Ⅱb期的细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。

4.流式细胞技术

流式细胞仪检测凋亡细胞是通过检查其光射特征及荧光参数时行的。细胞穿过流式细胞仪的激光束集点时使激光发生散射，分析散射光可以提供细胞大小及结构的信息。由于光散射牧场生并非凋亡细胞的特异性指标，细胞的机械性损伤和细胞坏死也可以使前向散射光减弱。因此，只有将光散射特性的检测与荧光参数的检测结合起来才能准确地辨认凋亡细胞。

细胞凋亡过程中核酸内切酶在DNA分子核小体间的降解，导致小分子DNA漏出，核DNA含量下降，细胞荧光染色后作流式细胞仪分析，可以发现在DNA直方图上正常二倍体细胞的Go/G1峰前出现一个亚二倍体峰（xub-G1峰，即AP峰--apoptotic peak）,代表凋亡细胞。

细胞凋亡的形态学检测结果直观,至今仍是判定细胞是否发生凋亡的金标准,但观察凋亡细胞的形态特征耗时费力,不适于大量凋亡样本的检测。