细胞凋亡的免疫检测技术2

（二）荧光标记法
1．材料与试剂 采用德国Boehringer- Mannheim公司In Situ Cell Death Detection 试剂盒，或美国Oncor公司ApopTagTM试剂盒，包括：
⑴ 生物素标记的-Dutp(Biotin-dUTP)或地高辛标记的-dUTP(Digoxingeningll-dUTP)１nmol/µl
⑵ TdT 酶（25U/μl）
⑶ 反应缓冲液
⑷ 洗涤缓冲液
⑸ 异硫氰酸荧光素（FITC）标记的亲合素或链霉亲合素（2.5µg/ml）或抗地高辛抗体（1︰30）
⑹ PI染液（含PI 5µg/ml及无DNA酶活性的RNA酶0.1%）
⑺ PBS 缓冲液
⑻ 塑料盖玻片
2.样品
⑴ 悬浮生长培养细胞的甩片或涂片
⑵ 贴壁生长的培养细胞
⑶ 冰冻切片
⑷ 常规石蜡切片
3.操作方法
（1）固定：培养细胞的制片或冰冻切片用4%多聚甲醛固定30min(4℃)后，用80%酒精再固定2h（-20℃）。常规4%中性福尔马林固定、石蜡包埋之切片进行脱蜡、水化。
（2）洗涤：玻片浸入PBS缓冲液，摇床上洗涤 5min,三次。
（3）反应：洗涤后的玻片用吸水纸吸干细胞或组织周围水分，按50μl/㎝2滴加反应液（每50μl反应液含TdT酶 0.5μl,标记的-dUTP 1μl）,使反应液均匀地覆盖于所有细胞或组织切片上,盖上塑料盖玻片,置湿盒中,37℃孵育1h。
（4）终止反应：去掉塑料盖玻片，将玻片置盛有洗涤缓冲液的染色缸内，洗涤两次，每次5min。
（5）FITC标记：洗涤后的玻片用吸水纸吸去细胞或组织周围水分，按50μl/㎝2滴加FITC反应液（含FITC 2.5μg/ml），室温下避光孵育10min。
（6）洗涤：将玻片置于洗涤缓冲液内，洗两次，每次5min。
（7）PI复染：将玻片置于盛有PI染液的染色缸内，室温下避光染色30min。
（8）封片：用盖玻片直接盖在含PI染液的玻片上，亦可用无色指甲油涂于盖玻片四周边缘，置暗盒中，尽早镜检观察。
4.结果判定：用荧光显微镜观察，选用蓝色激发光（波长488nm），所有的细
胞核均被PI着色，显示出红色荧光，而凋亡细胞被特异地标记上FITC，显示出黄绿色荧光。
(三) 酶标记法
1.材料与试剂 采用美国Oncor公司ApopTagTM-Peroxidase试剂盒，包括：
⑴ 过氧化物酶标记的抗地高辛抗体
⑵ 反应缓冲液
⑶ TdT酶
⑷ 反应终止/洗涤液
⑸ 平衡缓冲液
⑹ 蛋白酶K消化液：20μg/ml蛋白酶K溶于PBS。
⑺ 30% H2O2
⑻ DAB显色液：0.05%的diaminobenzidine(DAB)溶于PBS，用前过滤并加入
0.02% H2O2。
⑼ 甲基绿染液：0.5%甲基绿溶于0.1Mol/L枸橼酸钠，pH调整到4.0。
⑽ 塑料盖玻片及玻璃盖玻片
2．样品 同荧光标记法。
3．操作方法
⑴ 固定：同荧光标记法。
⑵ 内源性过氧化物封闭 玻片置于盛有0.5% H2O2缓冲溶液的染色缸内，室温下作用20min后，同荧光标记法洗涤。
⑶ 消化：玻片浸于盛有蛋白酶K消化液的染色缸，室温下消化15min，洗涤
同上。
⑷ 平衡处理：将细胞或组织周围液体用吸水纸吸干，滴加平衡缓冲液（按70µl／cm2）覆盖细胞或组织表面，盖上塑料盖玻片，室温下作用5min～10min。
⑸ 反应：移去盖玻片，倾去平衡液，用吸水纸吸干周围液体，滴加反应液（按50µl/㎝ 2，18μl TdT酶+36μl反应缓冲液），均匀覆盖在细胞或组织上，盖上塑料盖玻片，置于湿盒中，37℃温育1h。

⑹ 终止反应：移去盖玻片，将玻片置于盛有终止/洗涤液的染色缸内，37℃下洗涤30min（置摇床上振摇）。然后将玻片置于洗涤缓冲液内，洗两次，每次5min。
⑺ 地高辛抗体反应：用吸水纸吸干细胞或组织周围液体，滴加70μl过氧化物酶标记的地高辛抗体，均匀覆盖，加上塑料盖玻片，室温下置于湿盒中，孵育 30min。
⑻ 洗涤：置于洗涤缓冲液内，洗两次，每次5min。
⑼ 用吸水纸吸干细胞或组织周围液体，滴加新鲜配制的DAB显色液，均匀覆盖，加上塑料盖玻片，室温下作用3min～6min。
⑽ 洗涤：置于蒸馏水中洗涤3次，每次3min～6min。
⑾ 套染：将玻片置于盛有甲基绿染液的染色缸中，室温染色10min。
⑿ 洗涤：蒸馏水洗涤3次（置于摇床上），每次2min。
⒀ 脱水、封片：100%正丁醇，3次，每次2min。二甲苯，3次，每次2min。
明胶甘油封片。
4．结果判定 光学显微镜下观察，所有的细胞核均着绿色，凋亡的细胞核染
色质显示出特异性的棕黄色。