细胞凋亡小体和梯状DNA的观察(2)

四、实验程序
       1． 取样
　　1）直接撕取洋葱内表皮和刮取人口腔上皮细胞
　　2）烟草悬浮细胞的培养 烟草(Nicotiana tabacum)悬浮细胞在改良的MS液体培养基（内含MS基本培养基, KH2PO4 200 mg/L，2，4-D 1 ml/L，Gly 1.8 mg/L，VB1 0.6 mg/L）中继代培养，每7天继代一次，培养基pH 5.8，110 rpm/min摇床振荡，25℃悬浮培养。
       2．细胞凋亡的诱导
　　1）Cyt c处理：共做三组样品。试验组样品要先经Cyt c处理，浓度为12.5 μmol/L，如实验材料为人口腔上皮细胞，时间为1hr左右，如是洋葱内表皮或烟草悬浮细胞时，时间控制为48hr左右；正对照样品不需处理，为正常生长的细胞；负对照样品是将正常的细胞煮沸30min，使其坏死。在具体做实验时，也可以采用不同浓度的Cyt c进行处理：
　　（1） Cyt c诱导人口腔上皮细胞的凋亡步骤：
　　　　　①涂片；
　　　　　② 漂洗均参照细胞骨架实验的操作；
　　　　　③处理：浸泡于三种不同浓度的Cyt C溶液中；
　　　　　④分别于1hr后分时间段取出，用改良苯酚染液染色30min；
　　　　　⑤镜检观察。
　　（2）细胞色素C诱导的洋葱内表皮细胞凋亡步骤：
　　　　　①将洋葱内表皮切成1cm2的小块，浸泡于三种不同浓度的Cyt C溶液中；
　　　　　② 48hr后用改良苯酚染液染色30min，洗去表面染料，放在载玻片并压片；
　　　　　③镜检。
　　2） 高浓度Ca2+的处理：170 nmol/L或230 nmol/L 的CaCl2处理材料1hr左右，样品操作方法同上。
       3． 形态学观察
　　在显微镜下观察细胞形态并对试验组细胞进行凋亡率统计。随机选取5个视野，统计总细胞数和凋亡细胞数（以细胞核染色质出现明显的边缘化凝集为标志），计算凋亡率（%）=（凋亡细胞数/总细胞数）×100%。最后在普通光镜下照相。
       4． 基因组DNA的提取
　　对以上三组不同处理的样品分别进行基因组DNA的提取（方法参见第一章，实验2），并进行1% 琼脂糖凝胶电泳的检测。
五、 结果与分析
      1． 形态学变化
　　烟草悬浮细胞系BY-2的对照组细胞胞质透明，核圆形且周围有许多颗粒状物质分布，细胞多聚集成团（见图8-2 A，C）。实验组BY-2经12.5μmol/L Cyt c处理48hr后，显微镜下均可见细胞染色质明显聚集在核膜边缘、形成凋亡小体，细胞胞质内均匀分布着碎末状物质，细胞分散均匀，不成团状（见图8-2 B,D）。在光镜下可以观察到高钙诱导的细胞凋亡现象为，细胞核内染色体出现明显的聚集现象，见图8-3。
　　2． 琼脂糖凝胶电泳结果
　　经细胞凋亡诱导的细胞，分别提取总DNA。然后经1%的琼脂糖凝胶电泳，在紫外投射仪上观察。经 Cyt c处理不同时间细胞的DNA出现了不同断裂程度的DNA Ladder。