细胞凋亡检测(单染法)

实验概要

本实验介绍了细胞凋亡检测(Annexin-V-FITC 单染法)(Assay of Cell Apoptosis)的原理及操作流程。

实验原理

细胞凋亡或称程序性细胞死亡（Programmed  Cell  Death，PCD）是细胞的生命现象之一，它在机体的胚胎发育、组织修复及自身反应性T淋巴细胞的清除等方面起着十分重要的作用。细胞凋亡调节的失控可导致临床各种疾病的发生。如老年性痴呆与神经细胞凋亡过度有关，自身免疫性疾病和肿瘤与细胞凋亡的抑制有关。细胞凋亡有别于细胞坏死，它有一系列的细胞形态学和生物化学的改变，包括出现染色质浓缩、DNA降解、凋亡小体形成等。在正常的活细胞，磷脂酰丝氨酸（phosphotidylserine，  PS）位于细胞膜的内侧，但在凋亡的细胞，PS  从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。Annexin-Ⅴ（膜联蛋白-V）是一种分子量为35-36KD的Ca²  依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力结合。因此将Annexin-Ⅴ进行荧光素（如FITC、PE）或生物素（Biotin）标记，以标记了的Annexin-Ⅴ作为探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。

主要试剂

1. Annexin V-FITC（膜联蛋白-V-FITC） 500μl/250μl 20μg/ml
2. 标记缓冲液（Binding Buffer）40/20 ml
3. PBS（1×） 60/30 ml

主要设备

1. 20μl，200μl，and 1000μl 移液器和吸头
2. 微量离心管
3. 可调速离心机
4. 载玻片（用于荧光显微镜观察）
5. 盖玻片（用于荧光显微镜观察）
6. 去离子水
7. 冰块
8. 流式细胞仪或荧光显微镜

实验材料

小鼠

实验步骤

1. 凋亡细胞的制备：小鼠腹腔注射地塞米松25mg/kg体重，10h后解剖取胸腺，分离胸腺细胞。用PBS洗两遍，调整待测细胞的浓度为2 ×10⁶/ml，备用。
2. 200μl细胞悬液加入1ml冷PBS，轻轻震荡使细胞悬浮，1000rpm 4℃离心10min。

3. 重复步骤2两次。
4. 将细胞重悬于200μl 标记缓冲液。
5. 加入10μl Annexin V-FITC，轻轻混匀，避光室温反应15分钟或4℃反应30分钟。
6. 加入300μl标记缓冲液，立即上机（流式细胞仪）检测。

注意事项

1. 整个操作过程动作要尽量轻柔，切勿用力吹打细胞，尽量在4℃下操作。
2. 反应完毕后要尽快检测，因为细胞凋亡是一个动态的过程，反应一小时后荧光强度就开始衰变。
3. Annexin V-FITC是光敏物质，在操作时要注意避光。