细胞凋亡的检测方法综述1

一、形态学检测
（一）光学显微镜和倒置显微镜　　
1、未染色细胞
凋亡细胞的体积变小、变形，细胞膜完整但出现发泡现象，细胞凋亡晚期可见凋亡小体。贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落。　　
2、染色细胞
常用姬姆萨染色、瑞氏染色等。凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化，核膜裂解、染色质分割成块状和凋亡小体等典型的凋亡形态。　　
（二）荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜　　
一般以细胞核染色质的形态学改变为指标来评判细胞凋亡的进展情况。
常用的DNA特异性染料有：HO 33342 （Hoechst 33342），HO 33258 （Hoechst 33258）， DAPI。三种染料与　DNA的结合是非嵌入式的，主要结合在DNA的A-T碱基区。紫外光激发时发射明亮的蓝色荧光。
Hoechst是与DNA特异结合的活性染料，储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度，使用时用PBS稀释成终浓度为2~5mg/ml。

DAPI为半通透性，用于常规固定细胞的染色。储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度，使用终浓度一般为0.5 ~1mg/ml。
结果评判：细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期：Ⅰ期的细胞核呈波纹状（rippled）或呈折缝样（creased），部分染色质出现浓缩状态；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；Ⅱb期的细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体
（三）透射电子显微镜观察　　
结果评判：凋亡细胞体积变小，表面微绒毛消失，细胞质浓缩。凋亡Ⅰ期（pro-apoptosis nuclei）的细胞核内染色质高度盘绕，出现许多称为气穴现象（cavitations）的空泡结构，；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；细胞凋亡的晚期，细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。
二、DNA凝胶电泳
（一）琼脂糖凝胶电泳
凋亡细胞DNA断裂点均有规律的发生在核小体之间，出现180－200bpDNA片断，而坏死细胞的DNA断裂点为无特征的杂乱片断，利用此特征可以确定群体细胞的死亡，并可与坏死细胞区别。
1、常规的琼脂糖凝胶电泳
方法一
Western blot 分析Procaspase-3的活化，以及活化的Caspase-3及对底物多聚（ADP-核糖）聚合酶[poly（ADP- ribose）polymerase，PARP]等的裂解。
（1）收集细胞（5×106）1000r/min，离心5min，去上清。
（2）PBS洗一次，1000r/min，离心5min，去上清。
（3）加细胞核裂解液500μl重悬细胞，50℃水浴，3～5h，不时振摇或37℃过夜。
（4）加0.5ml平衡酚抽提，上下颠倒几次混匀，6000r/min，离心5min。
（5）上清移至另一Ep管，加0.5ml氯仿：异戊醇抽提，上下颠倒几次混匀，6000r/min，离心5min。
（6）上清移至另一Ep管，加50μl的3mol/L乙酸钠和2ml预冷无水乙醇，上下颠倒几次混匀，可见絮状白色沉淀物。

（7）置液氮5～10min，12 000r/min离心10min沉淀DNA，去上清，真空抽干或风扇下吹干残存液体。
（8）加50～100μl TE缓冲液，另加5μl RNase，37℃水浴30min。
（9）取20μl加上样缓冲液2～5μl，1％琼脂糖凝胶电泳（电压50V，1.5～2h），UV下观察。
方法二
（1）离心收集细胞（5×106），PBS（无Ca2＋和Mg2＋）洗1～2次。
（2）0.5ml TBE溶液重悬，37℃孵育30min。
（3）1mg/ml蛋白酶K 37℃处理30min。
（4）加入上样缓冲液0.1ml。
（5）25μl上样，1.5％的琼脂糖凝胶上电泳，2V/cm 6h。