细胞的原代培养实验

原代培养是直接从生物体获取细胞进行培养，由于细胞刚刚从活体组织分离出来，故更接近于生物体内的生活状态。这一方法可为研究生物体细胞的生长、代谢、繁殖提供有力的手段，同时也为以后传代培养创造条件。最常用的原代培养有组织块培养和分散细胞培养。组织块培养是将剪碎的组织块直接移植在培养瓶壁上，加入培养基后进行培养。分散细胞培养则是将组织块用机械法或化学法使细胞分散。从胎儿或新生儿的组织分离到活性最好的游离细胞，经典的方法是用蛋白水解酶(如胰蛋白酶和胶原酶)消化细胞间的结合物，或用金属离子螯合剂(如EDTA)除去细胞互相粘着所依赖的Ca²⁺，再经机械轻度振荡，使之成为单细胞。

孕鼠(胚胎小鼠) 新生1～3天乳鼠

1640培养液 PBS 胰蛋白酶 EDTA混合消化液 乙醇

手术器械 平皿 培养瓶 吸管 离心管 煤气灯 烧杯 超净工作台 二氧化碳培养箱 倒置显微镜

1.  取材
 

用颈椎脱位法使胎大鼠迅速死亡。然后，把整个动物浸入盛有75％乙醇的烧杯中数秒钟消毒，取出后放在大平皿中携入超净台。用消过毒的剪刀剪开用碘酒和乙醇再次消毒后的皮肤，剖腹取出肝脏或肾脏，置于无菌平皿中。

2.  切割
 

用灭菌的PBS 液将取出的脏器清洗三次，然后用眼科手术剪刀仔细将组织反复剪碎，直到成1 mm³ 左右的小块，再用PBS 清洗，洗到组织块发白为止。移入无菌离心管中，静置数分钟，使组织块自然沉淀到管底，弃去上清。

3.  消化、接种培养
 

吸取0.25％胰蛋白酶一0.02％EDTA 混合消化液1 ml，加入离心管中，与组织块混匀后，加上管口塞子，37 ℃水浴中消化8～10 分钟，每隔几分钟摇动一下试管，使组织与消化液充分接触，静止，吸去上清，向离心管中加入5～10 ml 含10％小牛血清的1640 培养基，用吸管吹打混匀，移入二个培养瓶中，置于二氧化碳培养箱中培养。

1. 严格进行动物皮肤消毒．使用三套器械取材。新生动物皮肤先用2％碘酊液消毒，成年鼠先用3％～5％碘酊液消毒后用75％乙醇消毒。

2. 严格进行无菌操作，防止细菌、真菌、支原体污染，避免化学物质污染。

3. 吸取液体前，瓶口和吸管进行火焰消毒；经火焰消毒后的吸管一定要用Hank’S液冷却。防止烫伤、烫死细胞。吸取液体时，避免瓶口和吸管接触碰撞。

4. 离心管入台前，管口、管壁应消毒。

来源《中国医科大学实验指导手册》《分子生物学实验指导》