细胞培养(换液／传代／冻存／复苏)操作说明

所需试剂

细胞完全培养基：★ 推荐使用海星生物细胞配套专用培养基

1. 细胞处理后的第二天，在显微镜下观察细胞状态，如死细胞较多且细胞密度较低，需要进行换液操作。

  （1）悬浮细胞请在高倍镜下观察，一般而言，活细胞轮廓圆润、界限清晰、透明度大、折光性强。如细胞活率较高，则继续正常培养。

  （2）贴壁细胞如观察到较多细胞漂浮，请在高倍镜下观察，判断漂浮着的细胞是死细胞还是暂未贴壁的活细胞。如细胞活率较高，则继续正常培养。

  （3）半贴壁细胞正常培养会有部分细胞漂浮，属正常现象。请在高倍镜下观察，判断漂浮着的细胞是否是死细胞。如细胞活率较高，则继续正常培养。

2. 如需换液，参考以下步骤：

 （1）悬浮细胞：收集培养容器中的所有细胞悬液。250 g离心4 min后弃去上清。使用预热的完全培养基重悬，将细胞悬液接种到合适的培养容器中。

 （2）贴壁细胞：直接弃去培养容器中的上清，添加预热的完全培养基至原培养容器中。

 （3）半贴壁细胞：收集培养容器上清中的所有细胞，250 g离心4 min后弃去上清。使用预热的完全培养基重悬，接种至原培养容器中。

3. 之后，每2~3天更换一次完全培养基，后续根据细胞生长密度和状态传代或冻存。

  注意: 若发现异常情况，应及时排查原因，并与我们联系。

所需试剂

细胞完全培养基

贴壁和半贴壁细胞需要同时准备以下试剂：

0.25% Trypsin-0.04% EDTA（货号: GUTP-R001，以下简称胰酶）

1×PBS（货号: GUPB-R001，以下简称PBS）

1. 预热完全培养基（贴壁和半贴壁细胞还需要预热胰酶和PBS）。

2. 细胞收集。

 （1）悬浮细胞直接收集培养容器中的所有细胞悬液至离心管中。

 （2）贴壁/半贴壁细胞需要对细胞进行消化处理，步骤如下：

         ① 用PBS洗涤细胞2次。洗涤过程中注意动作轻柔，清洗全面。

         贴壁细胞直接弃去培养容器中的培养上清。用PBS洗涤细胞2次，洗涤后的PBS直接弃去，无需保留。

         半贴壁细胞需收集培养容器中的培养上清至离心管中。用PBS洗涤细胞2次，洗涤后的PBS需收集至离心管中。

        ② 加入胰酶，迅速铺匀，确保其充分接触细胞表面。

        ③ 显微镜下观察消化情况，约70%~80%细胞收缩变圆后，轻拍培养容器外壁，使细胞脱离培养容器底面。立即加入胰酶双倍体积的完全培养基，轻摇培养容器，使培养基和胰酶迅速混匀，终止消化。

        ④ 吸取细胞悬液，吹打培养容器底面数次，尽可能将细胞都吹打下来。将细胞悬液转移至离心管中。

3. PBS洗涤培养容器1~2次，收集所有细胞悬液至离心管中。

4. 收集的所有细胞悬液250 g离心4 min。

5. 离心后去除上清。加入2 mL预热的完全培养基，轻柔吹打细胞沉淀，充分吹散、混匀。

6. 将细胞按(2.5~4.0) ×10^4个活细胞/cm2接种至适宜的培养容器内。

注意:  如未计数，也可按照适宜比例进行传代，但请根据细胞实际生长情况灵活调整传代比例。

7. 摇匀细胞，将培养容器放入细胞培养箱中。

8. 后续根据细胞生长密度和状态进行补液（悬浮细胞）/换液（贴壁/半贴壁细胞）、传   代或冻存等操作。

所需试剂

冻存液

★ 推荐使用海星HyCyte™一步冻存液（即用型、无血清、无需程序降温）

1. 待细胞生长至可传代的密度，即可准备冻存。

2. 消化细胞，取少量细胞悬液计数。细胞悬液经250 g离心4 min。

3. 离心后去除上清，用适量4℃预冷的冻存液重悬细胞。将细胞按比例或数量分装至冻 存管中。一般冻存密度为(1.0~2.0)×10^6个/mL。

 注意: 细胞长时间在非培养条件下放置会严重影响细胞的状态。如离心后用冻存液重悬计数，请 将细胞放置于4℃冰箱内，以减弱细胞代谢，较好的保持细胞状态。

4. 如使用海星一步冻存液，冻存管直接竖直放入-80℃冰箱即可完成“一步”冻存。如使用程序冻存液，需将冻存管放入提前预冷的程序降温盒后放入-80℃冰箱。

5. 24小时后可将冻存管转移到液氮进行长期保存。

    注意: 细胞不可长期保存在-80℃冰箱中。建议24 h后尽快转移至液氮中。

所需试剂

细胞完全培养基

★ 推荐使用海星生物细胞配套专用培养基

1. 开启37℃水浴锅。预热完全培养基，提前将细胞从液氮中取出，放于-80℃冰箱，让冻存管中液氮挥发。

2. 洁净工作台内准备15 mL离心管，加入5 mL预热的完全培养基。

3. 从-80℃冰箱中取出细胞。快速将冻存管置于37℃水浴锅内，快速晃动，使冻存液迅速融化。

    注意: ① 融化过程必须晃动冻存管，保证冻存液融化均匀。晃动时应避免水没过管盖增加污染风险。

             ② 管内冻存液融化至只剩一个约2mm直径的冰晶时，可停止水浴。继续晃动冻存管至冰晶融化。

4. 用75%酒精消毒冻存管表面。在洁净工作台内小心开盖，尽量避免气泡溢出，轻柔吹打数次， 转移至预先准备的离心管内。用少量完全培养基洗涤冻存管1~2次，一并收集至离心管内。

5. 250 g离心4 min。离心后去除上清。加入2 mL完全培养基，轻柔吹打细胞沉淀，充分 吹散、混匀。（如有台盼蓝可取少量细胞悬液进行染色计数）

6. 将细胞平均接种到1个T25培养瓶或底面积相当的培养容器中，加入足量完全培养基， 摇匀细胞，将培养容器放入培养箱中培养。

7. 复苏次日，观察细胞状态并换液，具体操作见”细胞换液”。

    注意: 贴壁/半贴壁细胞接种24 h内不应扰动。部分细胞贴壁较慢，复苏后48 h不应扰动，具体注 意事项见相应细胞说明书。

细胞处理原则

·  严格的无菌环境。务必保证实验室、超净台/生物安全柜和培养箱的清洁。

·  规范的操作方式。请按照操作说明描述的方式操作，注意操作细节。

·  需要合适的、质量可靠的实验耗材和试剂。使用的试剂必须经验证可靠，适宜细胞生长且批间差异小。