细胞培养中支原体污染的检测方法

细胞培养中最令人头疼的问题之一是支原体的污染。在人们日常生活工作环境中，支原体无处不在，它可以通过人的毛发、口腔、穿着的衣服、动物的皮毛以及日常的细胞培养的操作环境造成对细胞污染。
据说有11%的细胞株均受到不同程度的支原体污染，更有统计细胞培养中支原体感染发生率达到63%，对实验结果会产生不可预期的影响。而支原体污染的症状不如细菌、真菌、霉菌污染比较容易辨认，一般需要借助其他手段，如PCR、荧光染色试剂盒、培养菌落等方法。

造成细胞污染的支原体有很多，但主要有四种支原体：口腔支原体、精氨酸支原体、猪鼻支原体和莱氏无胆甾原体。由于支原体体积很小，直径约在0.2-2.0um之间，可以通过滤膜而直接造成培养基或血清的污染。另外，被支原体污染的细胞培养基液体往往并不浑浊，细胞受损程度并不明显，形态很少改变，这样就更增加 了人们对其的防范难度。

从形态结构上，支原体形态多变，它多吸附在细胞表面或散于细胞与细胞之间。从其理化或生物学特性上讲，所有支原体代谢均需胆固醇，部分需要精氨酸和葡萄糖。支原体的生存要求比细菌高，同时，除需基本营养物质外，还需10-20%血清，最适pH值在7.8-8.0之间，多数支原体呈兼性厌氧，其繁殖方式主要是二分裂繁殖，分裂和其DNA复制不同步，可形成多核长丝体。

由于支原体是一类缺乏细胞壁的微生物，因此它对作用于细胞壁类的抗生素（如青霉素G）不敏感。支原体对热的抵抗力和细菌相似，而对环境渗透压的变化比较敏感。支原体对细胞的影响，可以从两方面考虑。一方面是对细胞的直接影响，细胞被支原体污染后，增殖缓慢，部分细胞变圆，从瓶壁上脱落，部分细胞虽然表面变化不十分明显，实际上潜伏着多方面的危险。另一方面，支原体可以通过消耗培养基中的精氨酸，抑制细胞DNA、RNA的合成，降低细胞的抵抗力。因此，支原体污染对细胞的影响是非常广泛和深远的。

由于支原体种类不同，应采取不同的方法进行检测，常用的方法有如下几种：

1、观察细胞的形态和生长特征：支原体污染比较严重时可出现生长减慢，有的培养基pH明显变酸，并出现细胞病变，其病变特征与病毒感染相似，因此不能准确诊断。

2、分离培养法：大多数支原体可出现特有的典型菌落。该方法准确、可靠，但时间长。 但其实验周期较长，所以常用于进行对怀疑细胞的最后甄别。

3荧光染色法（DNA染色法）：此法快捷、简便、价廉，但其灵敏度有一定欠缺，易造成漏检，若细胞片制备不当则结果难以判断。

4、PCR法检测支原体：最为快速、灵敏，取样量少，既可进行细胞检测也可进行细胞上清的检测，同时可以检测8种支原体的污染，是目前常用的检测手段。但其成本较高，条件要求严格，有时易出现假阳性。

5、电子显微镜和免疫电子显微镜法：此法非常直观、准确，但对使用环境要求高，操作复杂，实验周期较长，敏感性不高，常作为样品的最后定性检测。

6、间接免疫荧光法和免疫印迹：简便、快速、特异性强，如果应用单克隆抗体试剂，效果会更好。

7、其他方法 ：放射性核素掺入法、放射自显影法、基因探针法等。