细胞培养攻略：细节决定成败

　　培养细胞就像养育BABY一样，要精心照料，用心呵护。最好每天都去看看它们，满足它们所需要的物质需求，防止出现培养箱缺水、二氧化碳不足、温度不够等各种小意外，还要注意很多小细节，以免开展重复的实验导致不必要的人力物力浪费。

　　那培养细胞都要注意哪些小细节呢？就让我们一起来看看吧！

　　1.细胞生长的营养来源

　　不同的细胞的培养基是不相同的，对于大多数肿瘤细胞来说，营养配方一般为：90%合成培养基（DMEM、RPMI1640、MEM等）和10%胎牛血清(FBS)；为了防止污染，可以适时加1%双抗，抗生素的使用应为短期。

　　Q：细胞培养基配方如何选择？

　　A: 一般购买细胞时，针对不同的细胞株，会有详细的介绍，包括生长的状态图、培养基的类型等。如人源肺癌细胞A549可用DMEM培养基，在胎牛血清的选择上也可以选用大品牌、来源可靠的胎牛血清，能提供较好的营养成分，以满足细胞株生长的需要。

　　Q：如果细胞生长缓慢，需要增加血清比例吗？

　　A：可以。

　　2.细胞生长的环境

　　舒适无菌的环境是细胞健康生活的重要基础。需要合适的器皿，不同形状、规格、用途多样的培养皿、培养瓶及培养板等，最终进入合适的恒温箱培养，如肿瘤细胞就需37℃，5%CO2的恒温箱中生长。

　　Q：细胞培养板及培养皿或培养瓶如何选择？

　　A：根据不同的应用选择不同的培养皿或容量板，如MTS用96孔板，细胞爬片用24孔，流式分析用6空等，具体应用可参见下表：

　　而选择培养皿还是选择培养瓶，就细胞培养状态来说差别不大，主要是培养瓶的安全系数更高一些，数量也会大一些，但是成本也相对较高，因此没有特殊要求时，一般用培养皿即可。

　　Q：血清是否要灭活处理，保证环境无菌？

　　A：这取决于您的应用。

　　灭活过程中，会导致血清中某些成分被破坏，如氨基酸，维生素，生长因子等。所以只有在您的实验对血清有特殊要求时，才会考虑对血清进行灭活处理。如您的实验对血清中的某种组分敏感，需要去除该组分。最常见的情况是需要去除血清中的补体蛋白，因为补体在机体中参与细胞杀伤，巨噬细胞和淋巴细胞活化，肥大细胞和血小板组胺释放，平滑肌收缩等过程，所以一般在免疫学相关研究中及肌细胞和干细胞的培养过程中需要对血清进行灭活处理。

　　另外，用gamma 射线辐照血清可灭活血清中的病毒，一般情况下，25-40kGy和30-45kGy是常用的辐射剂量。

　　3.细胞复苏与冻存

　　细胞复苏是指将冻存的细胞解冻之后再重新培养，细胞从冷冻停止生长状态恢复生长的过程。复苏过程如下图所示：

　　Q：细胞复苏后，为什么很多难以贴壁？

　　A：忽略培养基的问题，主要考虑细胞冻存时状态差或者复苏时动作太慢导致细胞死亡。切记最重要的融化速度要快，可不时摇动冷冻管，使之尽快通过最易受损的温度段（-5～0℃）。

　　细胞冻存则是将细胞放在低温（-70℃~196℃）环境，降低细胞内的代谢活动，最大限度的保存细胞活力，以便长期存储。

　　Q：目前细胞冻存液多采用的什么配方？

　　A：目前细胞冻存多采用DMSO二甲基亚砜或甘油作保护剂，细胞冻存液的配方有很多种，如培养基：血清：DMSO=7:2:1或8：1：1或5：4：1，或直接用血清：DMSO=9:1，一般高浓度血清有助于维护细胞活力，复苏存活率在80%～90%以上。

　　4.细胞的传代培养

　　细胞在培养过程中不断增殖，培养皿空间有限，细胞过密生长就会受到抑制，影响细胞的状态，因此我们要把细胞中的一部分分到别的培养皿里，这样细胞才能生长的好。

　　Q：细胞传代培养为什么要选择对数期细胞？

　　A: 细胞的生长和分裂，一般遵循以下模式：停滞期，对数期（指数期），平稳期（平台期）和衰退期。为了确保活力，遗传稳定性和表型稳定，必须使细胞保持在对数期。一般细胞长到70%~80%左右就可以传代了。

　　除了上述几个环节的关节问题外，细胞培养还有很多小问题如下：

　　Q：培养基多久换一次？

　　A: 正常情况下，培养液偏红色。如果细胞维持在pH6.5～6.6条件下，培养基变黄，说明培养液中代谢产物已堆积到一定量，细胞会脱落死亡，需要更换新鲜培养液。一般细胞生长旺盛时1～2天换一次，生长缓慢时，3～4天亦可。针对复苏后的细胞，建议隔天换液。

　　Q：血清应如何融解？

　　A：从冰箱中取出血清，放于2-8℃融化，融化过程中不时旋转（swirling mix）混匀。充分融解后分装或平衡到室温后使用。

　　Q：如果细胞形态不清晰或有异物等，如何处理？

　　A：可以考虑如下操作：首先，倒掉旧的培养基，用新的培养基或者PBS洗涤2-3次，再开始正式的消化、吹打。其次，把吹打下来的细胞悬液加入到新的培养瓶内。后续再密切观察。

　　Q：血清中出现絮状沉淀是否需要去除？如何去除？

　　A：多种原因可能导致絮状沉淀的形成，最常见的原因之一是融化过程中，脂蛋白聚集所致。该现象一般不会影响产品质量。可以400g离心5分钟，取上清，然后过滤。根据需要选择合适的滤膜孔径，一般最常用的是0.22um PES材质的滤膜。为避免滤膜阻塞，建议离心后取上清加入培养基内一起过滤而不是直接过滤血清。

　　总之，细胞培养是后续实验的基石，留心各种细节问题，严守灭菌处理的程序，保护好自己养的细胞，这样才能快乐地进行后续的实验。