细胞培养方法

细胞培养方法：

1.玻璃吸管和玻璃培养瓶的消毒:高压蒸汽灭菌15分钟以上;2)干烤消毒140度2小时以上;

2.无菌工作台先清洗后用75%酒精擦拭干净,紫外线照射40分钟以上;各种培养板照射3小时以上;

3.培养基(pH7.2)和血清配制好后要做无菌试验:将血清按10%加入培养基内,用无菌的玻璃离心管或玻璃瓶取完全培养基5-10ml置培养箱内培养2-3天,肉眼见无浑浊或沉淀等异物.分装后置-20度保存;

4.消化液(pH7.8)或其它加入液,应用高压蒸汽灭菌或一次性无菌滤器过滤除菌,分装成支置-20度保存;

5.培养箱应先用清水清洗后用75%酒精擦拭一遍(如有紫外线的应照射1小时以上,如有高温灭菌的应按程序来菌).至少每月一次.

6.进入操作时应注意先清洗双手及手腕,然后用75%酒精擦拭,操作时注意无菌台内空间层次.手及物品不要在暴露的瓶口上方来往,如果数量较多,培养瓶应放在与酒精灯平行地方便于操作,瓶与瓶之间应相隔一定的距离,开瓶(盖)时应先用75%酒精反复擦拭或用灯烧,开开后应用灯先烧口,然后烧盖.用完后同样操作.整个操作过程尽量在无菌台靠里面一点.

1.应遵守慢冻快融的原则.先将水温锅调至37-37.5度,取出冻存的细胞迅速放入后交细胞面浸至水面以下不断摇动至融化.

2.在无菌台内将完全培养基加入50ml的小培养瓶内,约5ml左右,然后用无菌吸管从冻存管内取出细胞,置培养并内轻轻摇晃,使细胞均匀后置培养箱内培养.

传代:

1.贴壁细胞:

对于贴壁细胞应先吸(倒)尽培养基,吸的越干净越好,以免中和后加入的消化液,使强度减弱.50ml培养瓶加入消化液约0.6ml,按此比例进行消化,(根据配制强度经验),晃动使消化液铺均匀置37度培养箱约2分钟,镜下见细胞收缩变圆或少数脱落后,轻轻振动瓶底使细胞全部脱落,加入2-3ml完全培养基后,轻轻吹打,使细胞基本成单个悬浮,然后分置其它无菌培养瓶内,加入完全培养基后继续培养或实验.

2.悬浮细胞:

一般传代可直接将细胞原液分置其它培养瓶内,加入完全培养基继续培养,如要高浓度可先离500rpm,5mi后加入完全培养基,轻轻吹匀后,分置其它培养瓶内加入完全培养基继续培养.

传代细胞培养注意事项：

1.严格的无菌操作

2.适度消化：消化的时间受消化液的种类、配制时间、加入培养瓶中的量等诸多因素的影响，消化过程中应该注意培养细胞形态的变化，一旦胞质回缩，连接变松散，或有成片浮起的迹象就要立即终止消化 。