细胞增殖的密度限制实验

实验方法原理 细胞在无限制培养基中培养，生长至包和密度。用放射自显影测定 3 H-胸腺嘧啶脱氧核苷标记细胞的百分比。

实验材料 传代用的细胞

试剂、试剂盒 生长培养基维持培养基D-PBSA胰蛋白酶

仪器、耗材 24 孔培养板培养皿

实验步骤

一、材料

无菌

1. 准备用于传代的细胞 

2. 生长培养基 

3. 维持培养基（无血清或生长因子），含有 37KBq/ml（1uCi/ml）的 3 H-胸腺嘧啶脱氧核苷，74 GBq/mmol(2Ci/mmol）

4. D-PBSA

5. 25% 胰蛋白酶 

6. 24 孔培养板，包括直径 13 mm 的盖玻片 

7. 直径 9 cm 培养皿 (细菌学级别，一个盖玻片一个平皿）

操作步骤

1. 用胰蛋白酶处理细胞，按 1×105 个/ml 接种至 24 孔培养板，1 ml/孔，每个孔放置一个直径 13 mm 的盖玻片。

2. 将细胞孵育在湿润的 CO2 温箱中 1~3d。

3. 将盖玻片转移至 9 cm 细菌级别培养皿中，每个培养皿含 20 ml 培养液，将培养皿置于 CO2 孵育箱中。

4. 继续进行培养，当盖玻片上的细胞汇合时，每 2d 换一次培养液。

5. 每隔 3~4 天，用胰蛋白消化 2 个盖玻片上的细胞并计数。当细胞在盖玻片上变密时，就必须加 200~500U/ml 粗制胶原酶到胰蛋白酶中，为的是使细胞完全分离，以便细胞计数。

6. 当细胞停止生长时，也就是两次计数并未显示有明显的增加，则加入 2.0 ml 37KBq/ml（1.0uCi/ml) 的 3 H-胸腺嘧啶脱氧核苷，达到终浓度 74 GBq/mmol(2uCi/mmol），继续孵育细胞 24 h。

注意事项

1.  处理 3 H-胸腺嘧啶脱氧核苷必须十分小心，虽然它只能发射低能量的β射线，但它能掺入 DNA，从而引起放射线损伤。因此操作时必须戴上手套，不要在垂直层流 罩中操作 H3-胸腺嘧啶脱氧核苷，而应在生物危害或细胞毒存物层流罩中操作，按照处理放射性同位素的德方法规处理废弃的液体和固体。

2.  将盖玻片转移至 24 孔培养板，进行胰蛋白酶处理，以利于进行放射自显影。细胞可在悬浮状态下进行固定，然后滴于载玻片上进行染色制备（见 方案 16.7，无需进行低渗处理），也可用甩片机将细胞离心至载玻片上（见方案 16.4）或通过真空抽滤吸附到滤纸上（见方案 16.5）。