细胞外囊泡（细胞微粒、外泌体）检测（一）

细胞外囊泡

细胞外囊泡（Extracellular Vesicles, EVs）是指从细胞膜上脱落或者由细胞分泌的双层膜结构的囊泡状小体，直径从40nm到1000nm不等。胞外囊泡主要由微囊泡（Microvesicles,  MVs）和外泌体（Exosomes, Exs）组成，微囊泡是细胞激活、损伤或凋亡后从细胞膜脱落的小囊泡，直径约为100nm – 1000nm；

外泌体由细胞内的多泡小体（multivesicular bodies）与细胞膜融合后以外分泌的形式释放到细胞外，直径约为40nm - 100nm。细胞外囊泡广泛存在于细胞培养上清以及各种体液（血液、淋巴液、唾液、尿液、精液、乳汁）中，携带有细胞来源相关的多种蛋白质、脂类、DNA、mRNA、miRNA等，参与细胞间通讯、细胞迁移、血管新生和免疫调节等过程。在糖尿病、心血管疾病、艾滋病、慢性炎症疾病以及癌症中都发现细胞外囊泡水平的升高，它们很有可能成为这类疾病的诊断标志物，因此，对细胞外囊泡进行准确的定性和定量研究显得尤为重要。
 
细胞外囊泡的检测方法

目前细胞外囊泡（EVs）的检测方法主要有扫描电子显微镜、原子力显微镜、动态光散射技术、纳米微粒追踪分析术（NTA）、流式细胞仪和ELISA等，由于通量高、用时短、操作简单，ELISA和流式细胞仪是比较常用的方法。ELISA方法容易受其他可溶性抗原的干扰，而且无法知道囊泡的大小、数量等信息；流式细胞仪不仅可以检测囊泡的大小、数量，而且通过细胞特异的标记物染色可以检测囊泡的来源，将囊泡进行分类，因此，流式细胞仪理论上是进行囊泡快速、高通量、多参数检测的最优选择。然而，传统流式细胞仪针对的样本主要是细胞，散射光的检测极限通常是300-500nm，而大多数细胞外囊泡的直径都在300nm以下，由于无法与背景噪音区分，直径小于300nm的细胞外囊泡很难被检测到，因此，囊泡数量往往被低估，检测结果自然也不准确[1]。

Apogee流式细胞仪的三大优势

（1）最灵敏的散射光分辨率

英国Apogee公司的A50-Micro突破传统流式细胞仪的检测极限，优化的光学模块和优异的散射光检测能力使得A50-Micro具有无法匹敌的灵敏度（<100nm）和最好的光散射分辨率（10nm）。图1展示的是A50-Micro与传统流式细胞仪（F500）及一些新型流式细胞仪（Gallios、Influx）的技术对比[1]，通过前向角散射光FC500只能勉强区分0.5μm和0.9μm的微珠，0.5μm以下的微珠则完全无法区分；Gallios和Influx在散射光检测能力方面有所提高，可以区分0.3μm和0.5μm的微珠，但0.3μm以下的微珠还是无法区分；而Apogee A50-Micro可以轻松地将0.14μm的微珠和0.3μm的微珠分成两个群（Fig 1.A）。从前向角散射光和侧向角散射光的散点图中可以看到，无论是FC500还是Gallios或Influx都只能部分的将0.3μm的微珠与背景噪音区分开，而A50-Micro可以清晰地将0.3μm的微珠与背景噪音完全区分开（Fig1.B中绿色数据点），并且只有A50-Micro可以检测到0.14μm的微珠（Fig1.B中紫色数据点）。这些结果说明，利用Apogee A50-Micro突出的高灵敏度和分辨率，我们可以轻松地将直径相差10nm以上的细胞外囊泡样本进行分群、计数、分析。另外，多达9通道荧光检测器，可以灵活使用细胞外囊泡特定抗原荧光抗体进行囊泡来源、数量的精确分析。Apogee A50-Micro是市场上唯一能够通过散射光检测小至100nm小颗粒的流式细胞仪，在细胞外囊泡的检测上优于任何一个竞争对手。

Figure 1. Technological improvement in forward scatter (FS) for microparticle (MP) measurement: (A) Beads resolution improvement: FS distribution of a blend of fluorescent latex beads (0.1/0.14, 0.3, 0.5 and 0.9 μm) with a threshold on fluorescence. (B) Background noise reduction: Scatters dot plot showing blue (0.9 μm beads), red (0.5 μm beads), green (0.3 μm beads) and violet (0.1/0.14 μm beads) beads with a FS threshold. Grey dots are background noise.