细胞外囊泡（细胞微粒、外泌体）检测（二）

（2）ZL的折射率校正功能

利用流式细胞仪进行细胞外囊泡检测往往需要使用标准微球（microspheres）来校正和设门（Set Gate），常用的微球材料有聚苯乙烯（Polystyrene）和二氧化硅（silica），国际血栓与止血协会和标准化委员会（ISTH SSC）推荐用于循环微粒（微囊泡）检测设门的Megamix就是聚苯乙烯微球。但是，最近越来越多的研究人员发现，用标准微球进行设门存在很严重的偏差，因为不同材料的微球的折射率（refractive index）是不一样的，相同直径的微球，折射率越大产生的散射光就越强。而且微球的折射率要远远大于生物囊泡的折射率，意味着微球产生的散射光强度是相同直径囊泡的几十倍。实际上，0.5mm聚苯乙烯微球（Megamix）产生的散射光强度相当于1.4mm的囊泡，而2.7mm的囊泡才能产生跟0.9mm聚苯乙烯微球（Megamix） 相当强度的散射光（表1）[2]。因此，如果我们用0.5mm的聚苯乙烯微球（Megamix）设门来检测小于0.5mm的细胞外囊泡将产生严重的偏差，检测结果也是不可信的。

*FSRI, forward scatter relative intensity measured on the Apogee A40. **Diameter of a lipid or cellular microparticle with the same forward scatter relative intensity as the particle that was measured. Equivalent microparticle diameter (mm) = 3.2911(PD) - 0.2768, where PD = polystyrene microsphere diameter (mm).

为了解决这一问题，Apogee的工程师们研发了ZL的折射率校正功能，无论是单参数的柱状图（Histogram）还是双参数的散点图（Cytogram），只要单击右键选择“Choose Calibration Scale”就会出现一条校正大小的标尺，并且可以根据检测样本的折射率来选择相应折射率的标尺（图2），那么我们就可以根据样本的直径大小和折射率这两个参数来设门和选择我们感兴趣的区域（region of interest, ROI），得到真实可靠的结果。

图2.折射率分别为1.38和1.42的微粒（180, 240,300 ,590, 880, 1300, 2000nm）在散点图中的位置。

（3）不依赖于抗体微珠的外泌体检测能力

由于外泌体（exosomes）的直径特别小（40 - 100nm），超出了传统流式细胞仪的检测范围，为此，很多公司提供了特异抗体标记的微珠用于外泌体的富集和流式分析，但这种方法的局限是操作复杂，对抗体特异性要求很高，而且无法知道外泌体的绝对数量。而Apogee A50-Micro超高的灵敏度和分辨率使其可以直接对样本中的外泌体进行分析和计数，操作简单，结果准确，美国个性化医疗的领军生物技术公司Caris Life Sciences正是利用A50-Micro来检测和分析复杂病人样本中的微囊泡和外泌体[3]。一流企业的选择，值得您的信赖！

[1] Lacroix R, Robert S, Poncelet P, Dignat-George F. Overcoming limitations of microparticle measurement by flow cytometry. Semin Thromb Hemost. 2010 Nov;36(8):807-18.
[2] Chandler WL, Yeung W, Tait JF. A new microparticle size calibration standard for use in measuring smaller microparticles using a new flow cytometer. J Thromb Haemost. 2011 Jun;9(6):1216-24.
[3] Abstracts from the Third International Meeting of ISEV 2014. Rotterdam, The Netherlands, April 30th – May 3rd, 2014. J Extracell Vesicles. 2014; 3:24214.