从组织中制备细胞核
体外细胞核连缀反应
体外细胞核连缀反应产物的分析
| 实验材料 | 动物组织 |
|---|---|
| 试剂、试剂盒 | PBS 蔗糖 |
| 仪器、耗材 | 电动匀浆器 特氟隆研杵 |
| 实验步骤 | 一、用超速离心法从组织中分离细胞核 1. 切下动物组织，放入置于冰上的平皿中，用冰冷的 PBS 冲洗。 2. 加少量蔗糖Ⅰ溶液，用剪刀或剃须刀片将组织切碎，转入一个干净试管中，加蔗糖Ⅰ溶液至终体积为每克组织 10 ml。 3. 用特氟隆研杵在电动匀浆器中将细胞匀浆裂解。 4. 于 1000 g 低温离心 5 分钟收集细胞核。 5. 用 2 ml 蔗糖Ⅱ，用移液管猛力吹打重悬沉淀，然后加蔗糖Ⅱ至每克组织 10 ml。 6. 离心： (1) 取一个 SW41 离心管（Beckman)，加入 2 ml 蔗糖Ⅱ，再将上一步所得悬液加于其上。 (2) 于 20000 r/min，4℃ 用 SW41 转头离心 1 小时，沉淀即是去除了膜成分与细胞碎片的干净的细胞核。 7. 吸去上层的细胞碎片和透明的垫层，一定要吸彻底，以免沉淀受到任何细胞碎片的污染。然后用干净的 Kimwipe 吸水纸将离心管内壁擦干净。 8. 加入 1 ml 蔗糖Ⅲ溶液，将细胞核沉淀刮下，吹打重悬。再用 1 ml 蔗糖Ⅲ清洗管壁以减少损失。 9. 于 1000 g，4℃ 离心 5 分钟收集细胞核，用 5 ml 冷的洗液重悬沉淀，于 1000 g 4℃ 离心 5 分钟收集细胞核。 10. 用细胞核保存缓冲液重悬沉淀（每克组织加 200 μl），迅速放入液氮罐。 二、用低速离心法从组织或培养细胞中分离细胞核 1. 前述第一、二步，切下组织用冰冷的 PBS 冲洗。 2. 在精胺-亚精胺匀浆缓冲液中将细胞匀浆化。 3. 裂解后，稀释样品，加 SSHB 至每克组织（或每 108 细胞）10 ml，以充分洗脱粗制细胞核。 4. 于 1000 g 离心 5 分钟，收集沉淀，然后用 5 ml SSHB 重悬，再于 1000 g 离心 5 分钟收集干净细胞核。 5. 用 1 ml NSB 重悬干净细胞核，转移至 1.2 ml 离心管，1000 g 离心 5 分钟收集细胞核。 6. 每克组织（或每 108 细胞）用 200 μl NSB 重悬沉淀，迅速放入液氮中冷冻保存。 三、用膨胀裂解法从培养细胞中分离细胞核 1. 用贴有胶带的特氟隆刀片或乳胶刮刷将细胞刮入冰冷的 PBS。 2. 每 100 mm 培养皿用 8 ml 冷 PBS，经二次悬浮与 800 g 离心清洗细胞。 3. 往细胞沉淀中加 4 ml RSB，置于冰上 5 分钟，使之在低渗缓冲液中膨胀裂解。 4. 加 10% Triton X-100 至终浓度 0.1%，混匀，再加 4 mol/L KCl 至终浓度 140 mmol/L。 5. 在一个 Bounce 手动匀浆器中匀浆 10~15 冲程，显微镜下监视裂解过程。如果 15 个冲程裂解不充分，则有必要在前一步提高 Triton X-100 的浓度（如有必要最高可到 0.5% )。 6. 100% 离心 5 分钟收集细胞核，用冷的洗液（2 ml/培养皿）重悬，再离心。 7. 用细胞核保存缓冲液重悬沉淀，放入液氮中冻存。 |
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