细胞瞬时转染可用于(1)观察目的基因功能(2)表达蛋白在某种细胞中的功能(短时间即可进行观察,但效应会很快丢失)。
实验方法原理 | 通过脂质体介导转染法及电穿孔等基因转染技术,将靶基因导入细胞,一般在转染后48小时左右,靶基因即可在细胞内表达。根据不同的实验目的,48小时后即可进行靶基因表达的检测等实验。 |
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实验材料 | 细胞样品 |
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试剂、试剂盒 | FuGENE 6脂质体 |
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仪器、耗材 | 电穿孔 |
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实验步骤 | 一般流程:
1)细胞接种:转染实验前天接种细胞,各种细胞的平板密度依据各种细胞的生长率和细胞形状而定。进行转染当天细胞密度应达到60%~80%覆盖。
2)细胞转染(脂质体、电穿孔、FuGENE6等)
3)48小时以后鉴定目的基因的表达情况。
前期准备:
l构建好的外源基因载体,或目的基因基本信息。
l待转染的细胞系(1×106个细胞,可传代,倍增时间小于48小时)以及细胞培养条件的说明。
l若需要检测靶基因的表达,请提供相应抗体。 收起 |
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注意事项 | 1. 转染48——72h后可检测基因表达。如用于重组蛋白、抗体生产等。
2. 由于各实验操作细节可能不同,建议转染前可做优化实验,确定sinofection转染试剂与DNA的最佳比例。
3. 如果在无血清条件下转染,使用含血清的正常生长培养基进行细胞铺板。在加入复合物前移去生长培养基,替换为0.5ml无血清培养基。 |
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其他 | 在细胞中加入复合物24-72小时后,分析细胞抽提物或进行原位细胞染色,检测报告基因活性。这依赖于细胞类型和启动子活性。对稳定表达,在开始转染一天后将细胞传代至新鲜培养基中,两天后加入筛选抗生素。进行稳定表达需要数天或数周。 |
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