细胞结构成分的离心分离技术1

就像可以把细胞从组织中分离出来进行研究一样，人们也可以把细胞器从细胞中分离纯化出来，以研究它们各自特有的的化学组成、酶活性和代谢特点。尽管在一个世纪前就有人试图分离细胞器，但直到20世纪40年代有了超速离心机和细胞匀浆技术后，才真正建立了细胞器的分离技术。用这一技术可以获得相对纯净的各种细胞器和大分子颗粒。使用超速离心机是这一技术的关键，因此该技术称为细胞结构成分的离心分离技术。

要进行细胞结构成分的离心分离，需先破碎细胞，通常用渗透压休克、超声振荡或研磨等方法。破碎细胞的悬液称为匀浆，其中包含了核、线粒体、高尔基体、溶酶体、过氧化物体等多种膜包围的囊泡，还可以有内质网形成的囊泡－微体，它们各有特定的大小和密度，因此可以用高速或超速离心的方法分开。

一．离心分离技术的基本原理和方法

（一）离心分离的基本原理

用超速离心机分离各种细胞结构成分有多种方法，它们都是根据颗粒或分子在离心场中的运动原理来设计的。悬浮液中的颗粒在离心力场中的沉降速度除了与颗粒的质量有关外，还与颗粒的密度、体积以及悬浮介质的密度和粘度有关，悬浮液中颗粒或分子的沉降速度可用stokes公式来表示。

式中dX/dt为颗粒沉降速度，X为颗粒到转轴中心的距离，t为时间，r为颗粒直径，ρp为颗粒密度，ρΜ为介质密度，η为介质密度，g为作用于颗粒的离心力。从公式中可以看到，颗粒在离心力场中的沉降速度与颗粒对介质的密度差ρp-ρΜ有重要关系：当ρp>ρΜ时，沉降速度为正数，颗粒向管底沉降；当ρp<ρΜ时，沉降速度为负数，颗粒向管上方移动；当 ρpΜ时，沉降速度为零，颗粒悬浮在介质中不移动。这一基本原理是差速离心和等密度区带离心方法的主要依据。 =ρ

根据Stokes公式，如果在相同的离心力场中，不同颗粒的沉降速度只决定于r、ρp、ρM和η4个因素。在实际应用中,不必分别测定这4个因素的具体数值,而是用沉降系数s (sedimentation coefficient)来表示颗粒沉降的参数,即

式中s为沉降系数,它与颗粒直径、颗粒密度、介质密度和介质粘度有关,而介质密度和粘度又是恒定的,因此s主要与颗粒的大小与密度有关，是表示颗粒大小和密度的参数。沉降系数的单位以秒（s）表示,一般细胞结构成分的沉降系数介于1～200×10-13s之间，习惯上把10-13s作为沉降系数的单位(Svedberg unit)，简称S。如果一种颗粒的沉降系数是8S，就说明实际的沉降系数是8×10-13s，S值越大，颗粒的沉降速度越大。

把s代入Stokes公式，可以简化为

这样，沉降系数就很容易在实验中测定了。

（二）离心分离的基本方法

细胞结构成分离心分离的方法主要有两类，一类是利用颗粒大小的不同进行离心分离，当颗粒密度大于介质密度(ρp >ρM)时，离心时颗粒向管底移动，移动的速度主要取决于颗粒的大小，大颗粒沉降快，小颗粒沉降慢，这一类方法包括差速度离心(differential centrifugation)和移动区带离心(moving-zone centrifugation)；另一类是利用颗粒的密度不同进行离心分离，称等密度离心(isodensity centrifugation)。

1、差速离心法

差速离心法（diffrential centrifugation） 通过一系列递增速度的离心，将不同大小颗粒分离。先在低速离心条件下把大的颗粒沉降到管底，其它颗粒留在上清液中；然后以较高的速度离心，把较大的颗粒沉淀于管底。这样依次把不同大小的颗粒逐级分离。这种方法适用大小差别较大颗粒的分离，如各种细胞器的初步离心分离。

2、移动区带离心法

移动区带离心法（moving –zone centrifugation） 对于大小差别较小的颗粒,可用移动区带离心法分离。方法是将要分离的样品放在介质溶液表面，形成一个狭带，然后超速离心，使不同大小的颗粒以不同的速度向管底方向移动，形成一系列区带，在最大的颗粒尚未到达管底时停止离心，从管底小孔中分次收集各种颗粒成分。这种方法必须注意离心时间,离心时间过长，所有颗粒都会沉到管底。经改进，用梯度蔗糖或甘油溶液(从管面到管底密度逐渐增高)作为移动区带离心的介质，可减少颗粒弥散，稳定颗粒的沉降,使形成的区带更明显，便于收集。在移动区带离心法中，介质的密度必须小于颗粒的密度。