细胞融合实验

实验概要

掌握细胞融合原理、应用融合细胞的方法以及细胞融合率的计算。

实验原理

细胞融合(Cell  fusion)，即在自然条件下或用人工方法(生物的、物理的、化学的)使两个或两个以上的细胞合并形成一个细胞的过程。人工诱导的细胞融合，在六十年代作为一门新兴技术而发展起来。由于它不仅能产生同种细胞融合，也能产生种间细胞的融合，因此细胞融合技术目前被广泛应用于细胞生物学和医学研究的各个领域。细胞融合的诱导物种类很多．常用的主要有灭活的仙台病毒(Sendai   virus)，聚乙二醇(Polyethyleneglycol，PEG)和电脉冲。目前应用最广泛的是聚乙二醇，因为它易得、简便，且融合效果稳定。PEG  的促融机制尚不完全清楚，它可能引起细胞膜中磷脂的酰键及极性基团发生结构重排。

主要试剂

1. 50％PEG(MW4,000)

2. Hanks 液(pH7.4)

主要设备

1. 显微镜

2. 离心机

3. 水浴箱

4. 刻度离心管

5. 试管

6. 载玻璃片

7. 盖玻片

实验步骤

1. 取新鲜鸡血以0.85％生理盐水制成10％的悬液。

2. 称取0.5克PEG(MW=4,000)放入试管内，在酒精灯上融化之，迅速加入0.5ml 预热的Hanks 液混匀制成50％的PEG 溶液。放入37℃水浴中待用。

3. 取上述10％的鸡红细胞悬液1ml 放入离心管中，再加入5ml Hanks 液混匀，然后以1,000rpm 离心5分钟，小心弃去上清，用指弹法将细胞团块弹散。

4. 取上述50％PEG 溶液0.5ml，在1 分钟内滴加到鸡红细胞悬液，边加边轻轻摇动混匀。待PEG 全部加入后静置1 分钟左右。此全部过程都要求在37℃水浴内进行。

5. 缓慢滴加9ml Hanks 液以终止PEG 的作用，在37℃水浴内静置5分钟。

6. 离心弃上清后，取一滴融合后的细胞悬液滴片，加盖片镜检。

7. 结果观察

在高倍镜下可以看到有两个或两个以上的鸡红细胞膜融合在一起，形成一个异核体细胞。要注意辨别融合细胞与重叠的鸡红细胞。

8. 融合率的计算

在高倍镜下随机计数200 个细胞(包括融合的与未融合的细胞)，以融合细胞(含两个或两个以上的细胞核的细胞)的细胞核数除以总细胞核数(包括融合与未融合的细胞核)即得出融合率。公式如下：

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