细菌耐药性检测方法

1、细菌耐药表型检测：判断细菌对抗菌药物的耐药性可根据NCCLS标准，通过测量纸片扩散法、肉汤稀释法和E试验的抑菌圈直径、MIC值和IC值获得。也可通过以下方法进行检测：

（1）耐药筛选试验：以单一药物的单一浓度检测细菌的耐药性被称为耐药筛选试验，临床上常用于筛选耐甲氧西林葡萄球菌、万古霉素中介的葡萄球菌、耐万古霉素肠球菌及氨基糖苷类高水平耐药的肠球菌等。

（2）折点敏感试验：仅用特定的抗菌药物浓度（敏感、中介或耐药折点MIC），而不使用测定MIC时所用的系列对倍稀释抗生素浓度测试细菌对抗菌药物的敏感性，称为折点敏感试验。

（3）双纸片协同试验：双纸片协同试验是主要用于筛选产超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）革兰阴性杆菌的纸片琼脂扩散试验。若指示药敏纸片在朝向阿莫西林/克拉维酸方向有抑菌圈扩大现象（协同），说明测试菌产生超广谱β-内酰胺酶。

（4）药敏试验的仪器化和自动化：全自动细菌鉴定及药敏分析仪如：Vitek-2、BD-Pheonix、Microscan等运用折点敏感试验的原理可半定量测定抗菌药物的MIC值。

2．β-内酰胺酶检测：主要有碘淀粉测定法（iodometric test）和头孢硝噻吩纸片法（nitrocefin test）。临床常用头孢硝噻吩纸片法，β-内酰胺酶试验可快速检测流感嗜血杆菌、淋病奈瑟菌、卡他莫拉菌和肠球菌对青霉素的耐药性。如β-内酰胺酶阳性，表示上述细菌对青霉素、氨苄西林、阿莫西林耐药；表示葡萄球菌和肠球菌对青霉素（包括氨基、羧基和脲基青霉素）耐药。

3．耐药基因检测：临床可检测的耐药基因主要有：葡萄球菌与甲氧西林耐药有关的MecA基因,大肠埃希菌与β-内酰胺类耐药有关的blaTEM、blaSHV、blaOXA基因，肠球菌与万古霉素耐药有关的vanA、vanB、vanC、vanD基因。检测抗菌药物耐药基因的方法主要有：

PCR扩增、PCR-RFLP分析、PCR-SSCP 分析、PCR-线性探针分析、生物芯片技术 、自动DNA测序；

4．特殊耐药菌检测

（1）耐甲氧西林葡萄球菌检测：对 1цg苯唑西林纸片的抑菌圈直径≤10㎜，或其MIC≥4цg/ml的金黄色葡萄球菌和对1цg苯唑西林纸片的抑菌圈直径≤17㎜，或MIC≥0.5цg/ml的凝固酶阴性葡萄球菌被称为耐甲氧西林葡萄球菌（MRS）。对MRS不论其体外药敏试验结果，所有的β-内酰胺类药物和β-内酰胺/β-内酰胺酶抑制剂均显示临床无效；绝大多数的MRS常为多重耐药，耐药范围包括氨基糖甙类、大环内酯类、四环素类等。

（2）耐青霉素肺炎链球菌检测：当对1цg苯唑西林纸片抑菌圈直径〈20㎜或MIC〉0.06цg/ml均应视为耐青霉素肺炎链球菌（PRSP）。临床治疗显示 PRSP对氨卞西林、氨卞西林/舒巴坦、头胞克肟、头胞唑肟，临床治疗疗效很差，但应检测对头胞曲松、头胞噻肟和美洛培南等的MIC以判断是否对这些抗生素敏感。

（3）耐万古霉素肠球菌检测：肠球菌对30цg万古霉素纸片抑菌圈直径≤14㎜或MIC≥32цg/ml被称为耐万古霉素肠球菌（VRE）。针对多重万古霉素药物目前尚无有效治疗方法，但对青霉素敏感的VRE可用青霉素和庆大霉素联合治疗，若对青霉素耐药而不是高水平耐氨基糖甙类可用壁霉素+庆大霉素。

（4）产超广谱β-内酰胺酶的肠杆菌科细菌检测： 超广谱β-内酰胺酶是一种能水解青霉素、广谱头孢菌素及单胺类的酶，主要由克雷伯菌、肠杆菌等细菌产生。当通过筛选法时对头孢泊肟、头孢他啶（10цg/片）抑菌圈≤22㎜或氨曲南、头孢噻肟（30цg/片）≤27㎜的菌株经头孢他啶（30цg/片）、头孢他啶/克拉维酸（30/10цg）；头孢噻肟（30цg/片）、头孢噻肟/克拉维酸（30/10цg）两组表型确证试验，其结果为两组中任何一组药物加克拉维酸与不加克拉维酸的抑菌圈相比，增大值≥5㎜时判断为产ESBL菌株（图7-13）。产ESBL克雷伯菌和大肠埃希菌不论其体外药物敏感试验结果如何，对青霉素、头孢菌素和氨曲南治疗无效。