细菌RNA制备实验——革兰氏阴性细菌中提取

RNA

STET氯仿乙酸钠氯化铯无水乙醇EDTA

离心机分光光度计摇床

1.  培养100 ml 大肠杆菌或500 ml 蓝细菌至对数生长期，加入1/20体积终止缓冲液，置于冰上。

2.  于4℃用JA-10转子17 700 g 离心5 min 收集细胞。

3.  用2 ml STET裂解液重悬细胞，加入100 μl 0.2 mol/l 的VRC，移入15 ml 聚丙烯管子。

4.  加入1 ml 缓冲液平衡酚，振荡1 min 再加1 ml 氯仿，振荡1 min，于4℃用JA-17转子10 000 g 离心10 min，收集水相。

5.  加入1/10体积3 mol/l 乙酸钠和2倍体积冰冷无水乙醇，于4℃ 10 000 g 离心10 min。

6.  用2 ml 0.2 mol/l VRC溶液重溶沉淀。

7.  用1：1酚/氯仿抽提2遍后，按步骤5重新沉淀。

8.  如用TLA-100.3转子

（1）重溶沉淀于2 ml DEPC处理水中，加1 g 固体CsCl并使之完全溶解。

（2）取2.25 ml 加在13 mm ×51 mm TLA-100.3聚碳酸酯超离心管的0.75 ml CsCl垫层之上，于20℃ 280 000 g 离心1 h。

9.  如用SW-41转子

（1）重溶沉淀于6 ml DEPC处理水中，加入4.5 g 固体CsCl并使之完全溶解。

（2）补加DEPC处理水至9 ml，并将其加在14 mm×89 mm Ultraclear超离心管的3 ml CsCl垫层之上，于20℃150 000 g 离心24 h。

10.  用无菌巴斯德吸管小心地移去界面的DNA层，然后移去上层CsCl液，倾去残余液体，作一记号标记RNA沉淀的所在。

11.  用纸巾擦干离心管壁，沉淀用0.36 ml DEPC处理水重溶并移至1.5 ml 的微量离心管中。

12.  加入1/10体3 mol/l 乙酸钠和2.5倍体积冰冷无水乙醇，于-70℃沉淀20 min，于4 ℃用微量离心机高速离心5 min。

13.  RNA沉淀加入1 ml 冰冷70%乙醇，再于4℃用微量离心机高速离心5 min。

14.  晾干沉淀，并溶解于200 μl DEPC处理过的水，测A₂₆₀和A₂₈₀定量RNA。

15.  最后调节浓度至4 μg/μl，于-70℃长期保存或以乙醇沉淀的形式保存。