经验：一步法Tunel细胞凋亡检测

　　使用说明：

　　1. 对于贴壁细胞或细胞涂片：

　　a. PBS或HBSS洗涤一次。

　　b. 如果细胞贴得不牢，可以干燥样品使细胞贴得更牢。

　　c. 用4%多聚甲醛或碧云天生产的免疫染色固定液(P0098)固定细胞30-60分钟。

　　d. 用PBS或HBSS洗涤一次。

　　e. 加入含0.1% Triton X-100的PBS或碧云天生产的免疫染色洗涤液(P0106)，冰浴孵育2分钟。

　　f. 转步骤5。

　　2. 对于悬浮细胞或细胞悬液：

　　a. 收集细胞(不超过200万细胞)，PBS或HBSS洗涤一次。

　　b. 用4%多聚甲醛或碧云天生产的免疫染色固定液(P0098)固定细胞30-60分钟。为防止细胞聚集成团，宜在侧摆摇床或水

　　平摇床上缓慢摇动的同时进行固定。

　　c. 用PBS或HBSS洗涤一次。

　　d. 用含0.1% Triton X-100的PBS或碧云天生产的免疫染色洗涤液(P0106)重悬细胞，冰浴孵育2分钟。

　　e. 转步骤5。

　　3. 对于石蜡切片：

　　a. 二甲苯中脱蜡5-10分钟。换用新鲜的二甲苯，再脱蜡5-10分钟。无水乙醇5分钟。90%乙醇2分钟。70%乙醇2分钟，蒸

　　馏水2分钟。

　　b. 滴加20μg/ml不含DNase的蛋白酶K，在20-37℃作用15-30分钟(不同组织的最佳作用温度和时间需自行摸索)。

　　c. PBS或HBSS洗涤3次。注意：这一步必须把蛋白酶K洗涤干净，否则会严重干扰后续的标记反应。

　　d. 转步骤5。

　　4. 对于冷冻切片：

　　a. 用4%多聚甲醛或碧云天生产的免疫染色固定液(P0098)固定细胞30-60分钟。

　　b. PBS或HBSS洗涤2次，每次10分钟。

　　c. 加入含0.1% Triton X-100的PBS或碧云天生产的免疫染色洗涤液(P0106)，冰浴孵育2分钟。

　　d. 转步骤5。

　　5. 配制TUNEL检测液：

　　参考下表配制适当量的TUNEL检测液，需充分混匀。注意：配制好的TUNEL检测液必须一次使用完毕，不能冻存。

　　1个样品5个样品10个样品

　　TdT酶 2μl 10μl 20μl

　　荧光标记液48μl 240μl 480μl

　　TUNE检测液50μl 250μl 500μl

　　6. 对于贴壁细胞、细胞涂片或组织切片：

　　a. 用PBS或HBSS洗涤2次。

　　b. 在样品上加50μl TUNEL检测液，37℃避光孵育60分钟。注意：孵育时需注意在周围用浸足水的纸或药棉等保持湿

　　润，以尽量减少TUNEL检测液的蒸发。

　　c. PBS或HBSS洗涤3次。

　　d. 用抗荧光淬灭封片液封片后荧光显微镜下观察。可以使用的激发波长范围为450-500nm，发射波长范围为515-

　　565nm(绿色荧光)。

　　7. 对于悬浮细胞或细胞悬液：

　　a. 用PBS或HBSS洗涤2次。

　　b. 加入50微升TUNEL检测液，37℃避光孵育60分钟。

　　c. PBS或HBSS洗涤2次。

　　d. 用250-500微升PBS或HBSS悬浮。

　　e. 此时可以用流式细胞仪进行检测或涂片后在荧光显微镜下观察。可以使用的激发波长范围为450-500nm，发射波长的

　　范围为515-565nm(绿色荧光)。

 

 

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