编码DNA结合蛋白的cDNA克隆的检测、纯化和鉴定实验

含有多个串联拷贝识别位点的、缺乏识别位点的（或含识别位点突变的）pUC重组质粒DNA

限制性内切核酸酶EcoRI及HhdIII 1 mol L Tris • Cl pH 7. 5 5 mmol L dCTP dGTP dTTP dATP 5000 Ci mmol [α32P] dATP 大肠杆菌DNA聚合酶I Klenow片段

1) 用EcoRI和HindIII在100μL中消化20μg适当的pUC重组质粒DNA，释放出含有2〜10个蛋白质结合位点的插入片段。

2) 在限制酶切反应中加入下列成分：

1 mol/L Tris • Cl, pH 7.5,终浓度 50 mmol/L 、dCTP、dGTP、dTTP 各 5 mmol/L,终浓度 100μLmol/L 、200μ Ci [α32P] dATP (5000Ci/mmol)、10 U Klenow 酶

室温下温育30 min。加入5 mmol/L dATP至100μmol/L继续温育30 min。

3) 加EDTA至20 mmol/L以中止反应。依次用25: 24 : 1的酚/氯仿/异戊醇及24 : 1 的氯仿/异戊醇抽提DNA。加乙酸钠至0. 3 mol/L,用100%乙醇沉淀DNA。

4) 重悬于200μL水中，加22μL 3 mol/L乙酸钠，pH 5.2，再用100%的乙醇沉淀。

5) 用0.75 mm厚、5%的非变性聚丙烯酰胺凝胶分离标记的DNA片段。

6) 用放射自显影使标记的DNA片段显迹。将含有结合位点片段的凝胶条切出，浸泡于1.5 mL洗脱缓冲液中于4℃振摇过夜。

7) 用移液器转移上清，用Elutip-d层析柱从上清中纯化标记的探针。用闪烁计数 (cpm)确定³²P标记的DNA结合位点探针的活性，并在4℃保存。

上述反应条件可产生具有2〜4×10⁷cpm/pmol比活性的DNA探针。足以用于筛选20张呈现约10⁶个噬斑的滤膜。

8) 37℃在LB/麦芽糖/氨苄青霉素培养液中培养大肠杆菌Y1090至生长饱和（通常过夜)。

9) 每涂布一块平板，在一个试管中将0.5 mL Y1090过夜培养物与λgtll文库（含有 3×10⁴〜5×10⁴pfu)混合。

10) 在37℃温育15 min使噬菌体吸附到细胞上。

11) 加9 mL顶层琼脂糖于每个试管中，颠倒混合几次，铺于含有LB/氨苄青霉素的150 mm平皿上。

12) 将平皿置于42℃温育约3 h直至可见细小噬斑。

13) 将平皿移至37℃温箱，不要让平皿降至37℃以下。

14) 准备用于覆盖的硝酸纤维素膜（用平头镊子操作），将膜在10 mmol/L 的IPTG溶液中浸30 min,在室温下空气中干燥60 min。

15) 用经IPTG浸润并晾干的硝酸纤维素膜覆盖于每个平皿上，37℃继续温育6 h。

16) 将平皿置于4℃冷却10 min。用针扎孔标记每张膜的位置。揭下膜浸于BLOTTO中。室温下孵育60min，并轻轻旋动。用Parafilm膜封好主平皿，保存于4℃。 '

17) 将所有的膜都浸于盛有结合缓冲液中（500 mL/10张膜）的碟子中，在室温下振荡温育5 min用新鲜的结合缓冲液重复洗涤2次（在筛选前滤膜可在4℃保存24 h)。

18) 将超声处理的小牛胸腺DNA在100℃加热10 min变性，然后放在冰上速冷。加入结合缓冲液至浓度为5μg/mL (最终体积为25 mL/10张滤膜）。在此溶液中加入³²P 标记的DNA结合位点探针（来自步骤7)至1×1O⁶〜2 ×10⁶cpm/mL,约 10-10mol/L将滤膜一块块地放到探针溶液中，室温下轻轻振荡60 min。

19) 分批洗膜，室温下每10张膜用500 mL结合缓冲液洗4次（每次洗7. 5 min,共 30 min)

20) 吸干滤膜，用塑料膜包裹，用增感屏在-70℃对×射线胶片曝光12〜24 h。

21) 将噬菌体平皿与放射自显影片对比，分离与阳性信号对应的琼脂糖块，并再生噬菌体液。

真正的阳性信号呈光晕状。可做多张不同曝光时间的自显影片以排除那些不能重复的信号点。

22) 用0.2 mL Y1090菌培养物和3 mL顶层琼脂糖对再生的噬菌体液（约5000 pfu/ 100mm平皿）铺板，参见步骤8〜11。

23) 用82mm滤膜制备硝酸纤维素膜复印品并进行二次筛选，见步骤12〜20。

24) 按照步骤1〜7标记缺少识别位点（或含有突变的识别位点）的pVC重组质粒 DNA,用本实验标记的探针来二次筛选真正阳性的噬菌体液。

25) 纯化噬斑，将阳性噬菌体覆盖上1滴氯仿，置于4℃保存。

筛选策略成功的关键在于cDNA文库的质量及所采用的位点识别探针。用随机引物构建的重组cDNA文库及识别多位点的探针是优选的材料。合成的探针在用于筛选 前应先与所要研究的蛋白质进行结合试验。如果有可能，应选择在一系列相 关位点中亲和力最高的位点来构建多位点探针。

其他所需试剂：

500 mmol/L EDTA pH 8.0，25 : 24 : 1 (体积比）酚/氯仿/异戊醇，24: 1氯仿/异戊醇，3 mol/L 乙酸钠 pH 5.2 100%乙醇，洗脱缓冲液，大肠杆菌Y1090，λgtll cDNA 文库，含有0.2%麦芽糖及50 mg/mL氨苄青霉素的LB培养液，0. 7%顶层琼脂糖 熔化后置47°C平衡，100和150 mm含有50μg/mL氨苄青霉素的LB培养平板 干燥并预热至37℃)，10 mmol/L IPTG (用无菌水制备成1 mol/L储液置于-20℃保存)，BLOTTO ，结合缓冲液，1 mg/mL经超声处理（长约1 kb)的小牛胸腺DNA 氯仿