耐多药结核分枝杆菌基因突变在耐药性检测中的应用

［摘  要］ 目的：探讨结核分枝杆菌耐链霉素(SM)和利福平(RFP)的耐药分子机制，应用聚合酶链反应一单链构象多态性(PCRSSCP)同时检测rpsL基因、rpoB基因突变在结核分枝杆菌耐SM和RFP耐药性测定中的应用价值。方法：采用PCRSSCP技术对168株结核分枝杆菌临床分离株rpsL基因、rpoB基因突变同时进行检测。即首先用PCR方法同时扩增RFP、SM的rpoB基因和rpsL基因，然后进行SSCP分析。结果：以结核分枝杆菌H37RV为对照，82株药物敏感株的rpsL基因、rpoB基因均未见SSCP图谱异常。特异性为100％。86株同时耐SM和RFP的耐药株中，68株(79．1％)有rpsL基因图谱异常；81株(94．2％)有rpoB基因图谱异常。结论:rpoB基因突变和rpsL基因突变分别是结核分枝杆菌耐RFP和SM的主要分子机制。应用PCRSSCP技术可同时快速检测结核分枝杆菌SM和RFP耐药性。

    ［关键词］ 结核分枝杆菌；药物耐受性；链霉素；利福平；rpsL基因；rpoB基因

    Abstract：Objective To study on the molecular mechanisms of rifampin and streptomycinresistant Mycobacterium tuberculosis.Detection rpoB and rpsL gene mutations in rifampin and streptomycinresistant Mycobacterium tuberculosis using Polymorphism(PCRSSCP).Methods 168 clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis of rpoB and rpsL genes were detected using PCRSSCP.Results Strain H37RV was used as control, SSCP pattern of rpoB,rpsL PCR amplification from 82 drug susceptible strains were all the same as control.The specificity was 100%.SSCP pattern of rpsL gene were different from control in 68 drug resistant clinical isolates.SSCP pattern of rpoB gene were different from control in 86 drug resistant clinical isolates.The sensitivity were 79.1%(rpsL),94.2%(rpoB),respectively.Conclusions The results confirm that mutations of rpsL and rpoB genes are the most important mechanisns in streptomycin and rifampin resistant tuberculosis, respectively.

    Key words:Mycobacterium tuberculosis；Drug resistance；Streptomycin；Rifampin； RpsL gene；rpoB gene

    利福平(RFP)、链霉素(SM)是结核病治疗中最重要的两种一线抗结核药物，其耐药情况日益严重。而传统的结核分枝杆菌耐药性测定由于耐药结核分枝杆菌生长极为缓慢，需6周~8周甚至更长时间，不能及时指导临床用药。近年来在耐药性快速测定方面取得了一些进展［1］。有文献报道［2］结核分枝杆菌耐SM的产生与其核糖体蛋白S12编码基因rpsL基因突变有关。而RFP耐药则与RNA聚合酶的β亚基的编码基因rpoB突变有关。因此，建立一种新的快速、有效的药敏试验方法对结核病的早期治疗具有重要的意义。我们在用PCRSSCP方法单独检测rpsL和rpoB基因突变时，发现在非变性聚丙烯酰胺凝胶中，这两种基因的迁移率不同，且位置不重叠，差异很大。因此，我们在一个反应中同时扩增rpsL基因和rpoB基因。在根据其SSCP图谱进行分析，这样就可以同时检测SM和RFP耐药性，大大节省了时间和材料。现将结果报告如下。

    1  材料和方法

    1．1  菌种来源  结核分枝杆菌H37RV标准株来源于中国药品生物制品检定所。82株药物敏感株和86株同时对SM和RFP耐药株来自解放军三零九医院和本院结核科。按结核病诊断细菌学规程进行菌种鉴定及药物敏感性试验，耐药株同时对SM和RFP耐药。受试临床分离株均鉴定为结核分枝杆菌。

    1.2  细菌DNA提取  结核分枝杆菌H37RV标准株、结核分枝杆菌临床分离株在LJ鸡卵培养基上37 ℃培养4周，分别刮取菌落研磨，以TE液悬浮。破壁采用经典的酶解法，用常规酚/氯仿提取。

    1．3  引物  分别由上海尘工和中科院微生物所合成。序列为rpsL15’AGTAAGGTCAAGACCGCGrpsL25’CTGCGTATCCAGCGAACC扩增片段长度267bp。rpoB１5’CGGATGACCACCCAGGACrpoB25’GGTTTCGATCGGGCACAT扩增片段长度258bp。PCR反应体系：采用25 μl反应体系，4×dNTPS终浓度为0．3 mmol/L，比较了rpsL和rpoB不同引物浓度对PCR扩增的影响。扩增程序为95 ℃预变性10 min，94 ℃变性1 min，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，共30个循环，最后一个循环72 ℃保温7 min，扩增产物经2％琼脂糖凝胶电泳，紫外检测出现267bp和258bp两条带。

    1．4  SSCP银染  取扩增产物5 μl~10 μl，加入等量甲酰胺变性液，煮沸变性10 min，立即冰浴5 min后，在8％非变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳。条件为6 ℃、100 V电压，电泳约2 h~3 h，电泳结束后，取凝胶板行硝酸银染色，观察结果并照像。

    2  结果

    2．1  PCR扩增时引物选择  实验证明rspL基因引物终浓度为0．1 μmol/L，rpoB基因引物终浓度为0．3　μmol/L时，扩增条带清晰,产量基本一致，扩增效果好。

    2．2  SSCP结果  168株结核分枝杆菌临床分离株中，82株药物敏感株SSCP同标准株H37RV图谱相同，无突变检出。86株同时耐SM和RFP分离株中，有68株有rspL基因发生突变，突变率为79．1％。同时有81株有rpoB基因发生突变，突变率为94．2％。结果见表1。

    表1  SM和RFP耐药与rspL和rpoB基因突变结果常规药敏试验   （略）注：a耐药株SSCP图谱与敏感株有差异

    3  讨论

    PCRSSCP是一种快速，准确的耐药分析方法。以往的报道均为单基因PCRSSCP［4］。近年来虽然也出现了一些新的结核病耐药性检测方法［3］线性探针如DNA序列分析、生物芯片等，但都有各自的局限性。或价格昂贵，或步骤繁琐，不适于推广。我们采用双基因PCR扩增后，再进行SSCP分析，结果表明，同时耐SM和RFP临床分离株rpsL基因突变率为79．1％，rpoB基因的突变率为94．2％，敏感株均无突变，特异性为100％，这与国内外报道相似［5，6］。表明rpsL基因突变、rlpoB基因突变是结核分枝杆菌耐SM和RFP耐药的主要分子机制之一。影响PCRSSCP的因素很多。由于rpoB基因是单挎贝，其PCR扩增的敏感性较低，且为属特异性，因此，我们在进行PCR扩增时，加大了rpoB扩增的引物量，并同时相应增加了4×dNTPS的量，选择了最适的扩增条件。在PCR扩增时由于两种引物相互竞争，扩增的条带可能以一条为主，而另一条淡或不甚清晰，但由于SSCP银染的敏感性很高，所以并不影响结果的判读。因此，对于同时进行两种基因的SSCP检测时，PCR扩增条件的选择显得非常重要。在进行SSCP时，由于rpoB和rspL基因扩增的产量可能有所不同：因此在显色时注意观察以H37RV对照的条带清晰为主，兼顾待测菌株的显色情况，适时终止反应。我们采用双基因扩增PCRSSCP技术同时对结核分枝杆菌临床分离株的SM、RFP耐药性进行检测使应用传统药敏法需时1个月~2个月缩短到2 d即可完成。并同时使SM和RFP耐药株得以同时检出，大大缩短了检测时间，适于临床的推广应用。

    参考文献：

    ［1］  Marttuke G J,Soini H,Vyhneueskiy B,et al.Rapid detection of rifampinresistant.Mycobacterium tuberculosis by sequencing and line probe assay［Ｊ］.Scand J Infect Dis, 1998，30(2):129132.

    ［2］  Gingeras TR,Ghandour G,Wang E,et al.Simultaneous genotyping and species identufication using hybrdization pattern recopnition analysis of genetic mycobacterium DNA arrays［Ｊ］.Genome Res,1998，8(9)：84358448.

    ［3］  张小刚，何秀云，陈红兵，等.结核分枝杆菌耐药分子机制的检测技术的研究［J］.中国现代医学杂志，2003，13(10):2931.

    ［4］  Williams D,Wagues Pack C,Eisenack K,et al.Characterization of rifampin in pathogenic Mycobacteria［Ｊ］.Antimicrob Agents Chemother,1994,38:23802386.

    ［5］  庄玉辉，何秀云，张小刚，等.利福平结核分枝杆菌耐药分子机制的研究［J］.中华结核和呼吸杂志，2000，23(10):711714.

    ［6］  Wison TM,Collins DM.ahpc,a gene involved in isoniazid resistance of the Mycobacterium Complex［Ｊ］.Mol Microbiol,1996,19:1025