聚合酶链反应构建重组DNA

DNA

TE 无水乙醇 DNA聚合酶 CTP

电泳仪 离心机 PCR仪

1.  制备模板DNA，如DNA不是经氯化铯梯度纯化的，100℃煮沸10 min 以灭活核酸酶。

2.  制备寡核苷酸引物，若PCR产物要进行平端克隆，就应该对引物的5'端羟基进行磷酸化处理。
 

图一、用PCR反应引入单一的酶切微点和产生符合读码框架的融合蛋白。

3.  建立标准的扩增反应，以矿物油覆盖表面，在以下条件下进行20~25轮扩增循环：94℃变性1 min，50℃退火1 min，72℃延伸3 min，最后一个循环在72℃延伸10 min 尽可能使扩增产物完整。
 

图二、序贯PCR法构建重组DNA分子，引物1b与基因2同源区域；引物1c有与基因1同源区域

4.  取少量反应混合物（4~8 ul），用琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳检测扩增效果。

5.  吸去矿物油上层，用氯仿抽提1次除去残存的矿物油，用饱和酚抽提1次，然后用无水乙醇沉淀DNA。
 

图三、用反向PCR插入酶切位点
 

6.  4℃高速离心10 min，沉淀用20 ul TE缓冲液溶解。

7.  用玻璃珠，电冼脱或低融点胶的酚抽法进一步纯化PCR产物可去除未掺入dNTP引物、无关的PCR产物和模板DNA。

8.  对于通过平端连接进行的克隆：用DNA聚合酶I （或klenow酶）修平扩增片段的3'末端。

9.  对于通过粘端连接进行的克隆：在20 ul 体积用合适的酶消化一半PCR只产物，用过量的酶消化数小时。

10.  用合适的末端互补的酶在20 ul 体积内消化0.2~2 ug 载体DNA，用CIP去瞵酸化，以阻止载体自连。

11.  用普通琼脂糖或低融点琼脂溏电泳分离线性化的载体。

12.  用玻璃珠、电洗脱、或酚抽法回收线状的载体。

13.  连接PCR片段和线状载体。

14.  取部分连接产物转化大杨杆菌，从转化体集中以小量制备法提取质粒DNA。

15.  用合适的酶消化转化体的质粒DNA，以琼脂糖凝胶电泳分析以确证片段的插人。

16.  测定质粒DNA中扩增片段的序列，检查有无突变，或者用生物化学或遗传学方面的功能分祈筛选转化体。

1. 如果出现非特异性带，则可能：

（1）引物设计不合理，出现发夹结构或二聚体；

（2）退火温度不合适；

（3）聚合酶质量不好；

（4）有污染；

（5）引物不纯或过量；

（6）模板过量。

随着科学技术的不断发展，在传统PCR技术的基础上发展了包括逆转录PCR，实时定量PCR等新技术，以及多重PCR、DNAshuffing，PCR芯片，固相PCR等改良技术。目前有运用恒温快速扩增技术作为DNA甲基化特异性检测方法来验证癌症的基因，为医学领域的深入探究提供新方法新思路。

文献：廖萍，刘茶珍，重组酶介导扩增技术与传统聚合酶链反应技术在甲状腺癌DNA甲基化检测中的应用对比，中国医药，2003,8（6）：797-799