实验材料 DNA
试剂、试剂盒 TE无水乙醇DNA聚合酶CTP
仪器、耗材 电泳仪离心机PCR仪
实验步骤
1. 制备模板DNA，如DNA不是经氯化铯梯度纯化的，100℃煮沸10 min 以灭活核酸酶。
2. 制备寡核苷酸引物，若PCR产物要进行平端克隆，就应该对引物的5’端羟基进行磷酸化处理。
图一、用PCR反应引入单一的酶切微点和产生符合读码框架的融合蛋白。
3. 建立标准的扩增反应，以矿物油覆盖表面，在以下条件下进行20~25轮扩增循环：94℃变性1 min，50℃退火1 min，72℃延伸3 min，最后一个循环在72℃延伸10 min 尽可能使扩增产物完整。
图二、序贯PCR法构建重组DNA分子，引物1b与基因2同源区域；引物1c有与基因1同源区域
4. 取少量反应混合物（4~8 μl），用琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳检测扩增效果。
5. 吸去矿物油上层，用氯仿抽提1次除去残存的矿物油，用饱和酚抽提1次，然后用无水乙醇沉淀DNA。
图三、用反向PCR插入酶切位点
6. 4℃高速离心10 min，沉淀用20 μl TE缓冲液溶解。
7. 用玻璃珠，电冼脱或低融点胶的酚抽法进一步纯化PCR产物可去除未掺入dNTP引物、无关的PCR产物和模板DNA。
8. 对于通过平端连接进行的克隆：用DNA聚合酶I （或klenow酶）修平扩增片段的3‘末端。
9. 对于通过粘端连接进行的克隆：在20 μl 体积用合适的酶消化一半PCR只产物，用过量的酶消化数小时。
10. 用合适的末端互补的酶在20 μl 体积内消化0.2~2 μg 载体DNA，用CIP去瞵酸化，以阻止载体自连。
11. 用普通琼脂糖或低融点琼脂溏电泳分离线性化的载体。
12. 用玻璃珠、电洗脱、或酚抽法回收线状的载体。
13. 连接PCR片段和线状载体。
14. 取部分连接产物转化大杨杆菌，从转化体集中以小量制备法提取质粒DNA。
15. 用合适的酶消化转化体的质粒DNA，以琼脂糖凝胶电泳分析以确证片段的插人。
16. 测定质粒DNA中扩增片段的序列，检查有无突变，或者用生物化学或遗传学方面的功能分祈筛选转化体。
