聚合酶链式反应(PCR)扩增和扩增产物克隆（三）

材料、设备及试剂

一、材料

不同来源的模板DNA。

二、设备

移液器及吸头，硅烷化的PCR小管，DNA扩增仪(PE公司)，琼脂糖凝胶电泳所需设备(电泳槽及电泳仪)，台式高速离心机。

三、试剂：

1、10×PCR反应缓冲液：500mmol/L KCl， 100mmol/L Tris·Cl， 在25℃下， pH9.0， 1.0％ Triton X-100。
　　2、MgCl₂ ：25mmol/L。
　　3、4种dNTP混合物:每种2.5mmol/L。
　　4、Taq DNA聚合酶5U/μl。
　　5、T4 DNA连接酶及连接缓冲液。
　　6、经SmaⅠ酶切和加dT的pUC质粒。
　　7、其它试剂：矿物油（石蜡油），1% 琼脂糖，5×TBE，酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)，无水乙醇和70％ 乙醇。

操作步骤

一、PCR反应

1、 依次混匀下列试剂

35μl H₂ O
　　5μl 10×PCR反应缓冲液
　　4μl 25mmol/L MgCl2
　　4μl 4种dNTP
　　0.5μl 上游引物（引物１）
　　0.5μl 下游引物（引物２）
　　0.5μl 模板DNA(约1ng)

混匀后离心5秒。

2、将混合物在94℃下加热5分钟后冰冷，迅速离心数秒， 使管壁上液滴沉至管底，加入Taq DNA聚合酶（0.5μl约2.5U），混匀后稍离心，加入一滴矿物油覆盖于反应混合物上。

3、 用94℃变性1分钟，45℃退火1分钟， 72℃延伸2分钟， 循环35轮，进行PCR。最后一轮循环结束后， 于72℃下保温10分钟，使反应产物扩增充分。

二、电泳

取10μl扩增产物用1％琼脂糖凝胶进行电泳分析，检查反应产物及长度。

三、PCR产物的纯化

扩增的PCR产物如利用T-Vector进行克隆，可直接使用，如用平未端或粘性未端连接，往往需要将产物纯化。

（一）酚/氯仿法

1、取反应产物加100μl TE.。
　　2、加等体积氯仿混匀后用微型离心机10000rpm离心15秒，用移液器将上层水相吸至新的小管中. 这样抽提一次， 可除去覆盖在表面的矿物油。
　　3、再用酚:氯仿:异戊醇抽提二次，每次回收上层水相。
　　4、在水相中加300μl 95％乙醇，置-20℃下30min沉淀。
　　5、在小离心机上10000rpm离心10min，吸净上清液。加入1ml 70％乙醇，稍离后，吸净上清液.重复洗涤沉淀2次。将沉淀溶于7ml ddH₂O 中，待用。

（二）Wizard PCR DNA纯化系统

Wizard PCR DNA纯化系统可以快速、有效、可靠地提取PCR扩增液中的DNA，提纯后的DNA可用于测序、标记、克隆等。 该系统中含有的试剂和柱子可供50次PCR产物的纯化，试剂包括：
　　50ml Wizard PCR DNA纯化树脂
　　5ml 直接提取缓冲液
　　50支 Wizard微型柱

1、吸取PCR反应液水相放于1.5ml eppendorf管中。
　　2、加100ml直接提取缓冲液，涡旋混匀。
　　3、加1ml PCR DNA纯化树脂，1分钟内涡旋混合3次。
　　4、取一次性注射器， 取出注塞，并使注射筒与Wizard微型柱连接，用移液枪将上述混合液加入注射筒中，并用注塞轻推，使混合物进入微型柱。
　　5、将注射器与微型柱分开，取出注塞， 再将注射筒与微型柱相连，加入2ml 80%异丙醇，对微型柱进行清洗。
　　6、取出微型柱置于eppendorf管中，12000g离心20秒，以除去微型柱中的洗液。
　　7、将微型柱放在一个新eppendorf管中，加50μl TE或水，静止1分钟后，12000g离心20秒。
　　8、丢弃微型柱，eppendorf管中的溶液即为纯化DNA，存放于4℃或-20℃。