3分钟读懂环介导等温扩增（LAMP）那些事儿

　　什么是LAMP？

　　环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是Notomi等人于2000年提出来的一种新的核酸扩增技术。针对靶基因的6个区域设计4种特异引物，在链置换DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)作用下，可以在60-65℃温度范围内进行恒温扩增。在扩增的初始阶段，由于引物的延伸和初级扩增子的连续链置换，形成了哑铃状反应中间体，相较于PCR反应扩增机制更为复杂，但是却大大缩短了扩增时间，15-60分钟内即可实现109-1010核酸扩增，可以一步完成基因的扩增和检测，已被广泛地应用于病原微生物检测和传染性疾病诊断等领域。

　　LAMP的作用机制

　　LAMP 反应可分为复制起始、循环扩增，延伸三个阶段（如下图所示）。LAMP不同于PCR，它不需要通过热变性来促进双链DNA转化为单链。在复制起始阶段，由于双链DNA在65°C条件下处于动态平衡稳定状态，一条LAMP引物可以与双链靶基因的互补序列结合，在链置换DNA聚合酶作用下，启动DNA的合成，最终形成哑铃状互补链，即为进入循环扩增的起始原料。继而通过连续链置换进入循环扩增阶段，最后延伸阶段，扩增的最后产物是具有不同个茎环结构、多环花椰菜样结构的DNA的混合物，且产物DNA为扩增靶序列的交替反向重复序列。

图1. LAMP 反应过程图。F1、F2、F3是靶基因上约20 bp长的序列片段，B1、B2、B3则是位于互补链上长度约20 bp的序列，F1c和B1c分别是F1和B1的互补区。

　　LAMP与PCR扩增区别

　　什么是RT-LAMP？

　　逆转录环介导等温扩增法(RT-LAMP) 将环介导等温扩增(LAMP)与逆转录反应相结合，直接检测出RNA的方法，当它与反应混合物中的pH指示剂耦合时，可以通过颜色变化获得检测结果。在新冠检测应用上，可以在60-65°C等温条件下，一步进行RNA逆转录和核酸扩增过程，30 min即可得到结果，同时检测ORF1ab基因、E基因和N基因。由于ORF1ab基因具有很强的特异性，N基因具有很强的敏感性，这种方法可以保证病毒检测的灵敏性和特异性。

　　RT-LAMP与RT-qPCR的区别？

★LAMP引物设计

　　LAMP的特点是使用4或6种不同的引物，专门设计用于识别目标基因的6个不同区域，包括3'端的F3c、F2c和F1c区域和5'端的B1、B2和B3区域，如图1所示。引物设计包括：

　　正向内引物（Forward Inner Primer, FIP）：由F2区和F1c区域组成，F2区与靶基因3’端的F2c区域互补，F1c区与靶基因5’端的F1c区域序列相同；

　　正向外引物（Forward Outer Primer , FOP/ F3 ）：由F3区组成，与靶基因的F3c区域互补；

　　反向内引物（ Backward Inner Primer , BIP ）：由B1c和B2区域组成，B2区与靶基因3’端的B2c区域互补，B1c区域与靶基因5’端的B1c区域序列相同；

　　反向外引物（Backward Outer Primer, BOP/B3）：由B3区域组成，与靶基因的B3c区域互补。